蛋白質(zhì)在色譜介質(zhì)上吸附的結(jié)構(gòu)變化及其熱力學(xué)研究.pdf

1、色譜微觀過(guò)程研究對(duì)于色譜介質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計(jì)和定向優(yōu)化以及色譜操作過(guò)程優(yōu)化有著極其重要的意義。雖然疏水、離子交換色譜技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，但是，相關(guān)的機(jī)理解釋仍然是有限的，因此作者開(kāi)展了如下研究工作：
　　一、利用熒光標(biāo)記蛋白、激光共聚焦顯微鏡、H/D交換核磁共振等技術(shù)分別考察了不同孔徑聚苯乙烯（PST）色譜介質(zhì)介導(dǎo)的蛋白吸附、保留以及擴(kuò)散情況。并從殘基水平上給出蛋白質(zhì)與PST疏水介質(zhì)的微觀作用機(jī)理以及宏觀保留行為之間的關(guān)系。結(jié)論如

2、下：1、蛋白質(zhì)的吸附保留對(duì)大孔道介質(zhì)并不敏感，這種敏感性只存在于介孔范圍。隨著孔徑的不斷增大，蛋白質(zhì)色譜保留呈減小趨勢(shì)，與介質(zhì)結(jié)合力減弱，而擴(kuò)散因子逐漸增大。2、吸附態(tài)溶菌酶殘基信號(hào)丟失程度顯著大于天然態(tài)；溶菌酶在14nm和30nm孔內(nèi)表現(xiàn)出顯著的信號(hào)損失情況，表明其結(jié)構(gòu)去折疊嚴(yán)重。而120nm孔徑，溶菌酶去折疊較弱，能保持其更緊湊結(jié)構(gòu)避免氘代反應(yīng)。
　　二、考察了不同柔性蛋白在與陽(yáng)離子交換介質(zhì)（SP Sepharose FF）相

3、互作用過(guò)程中色譜保留行為的差異。結(jié)論如下：帶凈電荷相等的蛋白質(zhì)在離子交換色譜中，壓縮因子ks越大的柔性蛋白色譜保留越強(qiáng)。并利用H/D交換核磁共振技術(shù)原位實(shí)時(shí)捕捉了陽(yáng)離子交換多孔介質(zhì)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)變化信息。蛋白表面靜電勢(shì)模擬計(jì)算結(jié)合氫氘標(biāo)記的蛋白核核磁數(shù)據(jù)確定了三種蛋白與陽(yáng)離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)。結(jié)論如下：1、三種蛋白吸附態(tài)殘基酰胺氫信號(hào)的丟失都要多于天然態(tài)；且柔性越大的蛋白，其殘基損失率越大。2、陽(yáng)離子交換介質(zhì)表面的靜電基團(tuán)是介導(dǎo)溶菌酶去

4、折疊行為的主要機(jī)制。不同結(jié)構(gòu)片段的去折疊程度不同，無(wú)規(guī)則卷曲（coil，bend，and turn）去折疊明顯，二級(jí)結(jié)構(gòu)域（α-helix，β-sheet）則得到保護(hù)。與疏水作用色譜相比，離子交換過(guò)程蛋白分子去折疊程度明顯減弱。
　　三、使用等溫滴定量熱法（ITC）測(cè)量得到不同柔性蛋白在IEC介質(zhì)上吸附過(guò)程的熱量變化，并計(jì)算得到吸附過(guò)程的吉布斯自由能變△G，焓變△H，熵變△S，通過(guò)分析，結(jié)論如下：1、溶菌酶（LYS）和核糖核酸酶（