四川冬菜腌制過(guò)程品質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及微生物宏基因組研究.pdf

1、目前四川冬菜的研究水平較低、缺乏系統(tǒng)的理論體系支撐成為制約其工業(yè)化發(fā)展的主要因素，因此對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的理論研究顯得尤為迫切。本課題采用宏基因組或傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)不同腌制時(shí)期四川冬菜中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，探索了其在整個(gè)腌制過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并鑒定出每個(gè)時(shí)期中的優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)和相對(duì)豐度;通過(guò)對(duì)不同腌制時(shí)期四川冬菜中亞硝酸鹽、蛋白質(zhì)、氨基酸、顏色以及微觀形貌等指標(biāo)進(jìn)行分析，較為全面的描述了四川冬菜整個(gè)腌制過(guò)程中的品相變化規(guī)律;采用固

2、相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)技術(shù)和電子鼻(E-nose)技術(shù)對(duì)不同腌制時(shí)期四川冬菜中的揮發(fā)性成分和風(fēng)味輪廓進(jìn)行分析，利用主成分分析(PCA)成功區(qū)分了不同腌制時(shí)期的冬菜樣品;結(jié)合宏基因組功能注釋結(jié)果，分析了腌制過(guò)程中的微生物與四川冬菜中亞硝酸鹽、氨基酸、顏色以及風(fēng)味的關(guān)系。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.四川冬菜微生物群落結(jié)構(gòu)分析
　　(1)為全面掌握四川冬菜腌制過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，

3、采用宏基因組或傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進(jìn)行分析，鑒定到的細(xì)菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度遠(yuǎn)大于真菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度，表明冬菜腌制過(guò)程中存在的主要微生物為細(xì)菌而不是真菌，且微生物總量隨腌制時(shí)間呈下降趨勢(shì)。
　　(2)四個(gè)冬菜樣品中總共鑒定到85種細(xì)菌和5種真菌。0#～3#樣品中細(xì)菌種類(lèi)（包括亞種）分別為55種、36種、31種和4種，真菌種類(lèi)分別為1種、2種、2種和1種。
　　(3)在0#～3#樣品中同時(shí)鑒定到的微生物有1種，即短乳桿菌（Lactob

4、acillusbrevis）。同時(shí)在三個(gè)樣品中出現(xiàn)的微生物有10種，都出現(xiàn)在0#～2#樣品中，且全部是細(xì)菌，包括3種乳桿菌、1種乳球菌、4種明串珠菌、1種嗜冷桿菌和1種魏斯氏菌。在兩個(gè)樣品中同時(shí)鑒定到的微生物有22種，包括19種細(xì)菌和3種真菌。
　　(4)1#和2#樣品中相同的微生物種類(lèi)有24種，分別占各自微生物總種數(shù)的63％和71％，且各自樣品中相對(duì)豐度排名前十的微生物中有8種相同，表明1#和2#樣品的微生物菌群結(jié)構(gòu)較為相似，微

5、生物種類(lèi)在四川冬菜腌制1～2年期間變化較小。
　　(5)未腌制冬菜（0#樣品）中的優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌和節(jié)桿菌，相對(duì)豐度分別達(dá)到21.98％和6.74％;腌制中期（1#和2#樣品）的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌，相對(duì)豐度分別達(dá)到87.88％和68.86％，其中短乳桿菌相對(duì)豐度最高，分別達(dá)到84.19％和65.97％;腌制后期（3#樣品）微生物種類(lèi)極少，優(yōu)勢(shì)菌群可能為芽孢桿菌。
　　2.四川冬菜品相分析
　　(1)為了解四川冬菜的食用

6、安全性，選取腌制食品中常見(jiàn)的有害物質(zhì)亞硝酸鹽作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)其在腌制過(guò)程中的含量變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四川冬菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量呈下降趨勢(shì)。腌制6個(gè)月時(shí)，亞硝酸鹽含量相比未腌制時(shí)下降了70％，腌制30個(gè)月以后，亞硝酸鹽含量只有1mg/kg干基～2mg/kg干基，遠(yuǎn)低于國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限量。
　　(2)為了解四川冬萊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值變化，以粗蛋白和氨基酸含量為指標(biāo)，對(duì)其在腌制過(guò)程中的變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四川冬菜腌制過(guò)程中粗蛋

7、白含量、總氨基酸含量和必需氨基酸含量均呈下降趨勢(shì)。未腌制冬菜中粗蛋白含量達(dá)到30g/100g干基，到36個(gè)月時(shí)僅為6.6g/100g干基，相對(duì)于未腌制樣品降低了78％;必需氨基酸在未腌制樣品中占比約23％，但腌制6個(gè)月后其占比上升到33％～36％，且基本維持穩(wěn)定;未腌制樣品中谷氨酸和脯氨酸（非必需氨基酸）含量均高于必需氨基酸總量，而其在前6個(gè)月中分別降低了48％和89％，直接導(dǎo)致了非必需氨基酸比例下降。
　　(3)為了解四川冬菜的

8、外觀及形貌變化，對(duì)四川冬菜腌制過(guò)程中的顏色和微觀形貌進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四川冬菜腌制過(guò)程中莖內(nèi)側(cè)、莖外側(cè)和葉片三個(gè)部位的初始顏色不一樣，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間腌制后，整個(gè)冬菜的顏色都較為均勻，顏色經(jīng)過(guò)一個(gè)由明轉(zhuǎn)暗、從綠變紅和自黃而藍(lán)的過(guò)程轉(zhuǎn)變，這與肉眼觀察到的情況比較一致;冬菜腌制中后期(24～39個(gè)月)，對(duì)顏色變化不太敏感的人（△Eab*＞5.0才能分辨出顏色變化）會(huì)認(rèn)為各部位之間的顏色沒(méi)有差別，即使對(duì)顏色變化較為敏感的人(△Eab*＞3.0就

9、能分辨出顏色變化)，也會(huì)認(rèn)為腌制39個(gè)月時(shí)各部位間的顏色沒(méi)有差別。微觀形貌觀察到四川冬菜的組織結(jié)構(gòu)由清晰逐漸變得模糊，由完好逐漸變?yōu)槠茡p。
　　3.四川冬菜風(fēng)味分析
　　(1)為明確四川冬菜中與其獨(dú)特風(fēng)味相關(guān)的特征物質(zhì)，采用SPME-GC-MS方法對(duì)四川冬菜腌制過(guò)程中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)不同時(shí)期冬菜中共檢測(cè)出70種不同的揮發(fā)性成分。0#～3#樣品中揮發(fā)性成分分別有21種、8種、32種和38種，總含量分別為37

10、9μg/g干基、44μg/g干基、968μg/g干基和325μg/g干基。
　　(2)至少在兩個(gè)不同腌制時(shí)期中出現(xiàn)的揮發(fā)性成分有21種，在四個(gè)不同時(shí)期中的含量分別占到總揮發(fā)性成分含量的77.3％、96.5％、89.9％和78.9％，這些成分可能對(duì)四川冬菜的風(fēng)味具有重要影響。其中，在四個(gè)不同時(shí)期樣品中均檢測(cè)到的揮發(fā)性成分有3種，分別是異硫氰酸烯丙酯、苯乙醇和苯甲醛;在三個(gè)不同時(shí)期樣品中檢測(cè)到的揮發(fā)性成分有2種，分別是檸檬烯和壬醛;在

11、兩個(gè)不同時(shí)期檢測(cè)到的揮發(fā)性成分有16種，它們是甲苯、(Z)-β-羅勒烯、α-蓽澄茄油烯、石竹烯、β-古蕓烯、δ-蓽澄茄烯、苯酚、丁香酚、己酸-4-十六酯、草蒿腦、茴香腦、己醛、(E，E)-2，4-二烯醛、苯乙醛、苯乙酮和β-紫羅酮。
　　(3)為明確各腌制階段四川冬菜中與風(fēng)味相關(guān)的特征成分，分別對(duì)檢測(cè)到的70種揮發(fā)性成分和21種共有成分進(jìn)行PCA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組揮發(fā)性成分都可以較好的區(qū)分不同腌制時(shí)間的冬菜樣品。0#樣品的風(fēng)味特征主

12、要取決于硫氰化合物、醇類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)，1#樣品的風(fēng)味特征主要取決于甲苯和4-氧-戊酸丁酯，2#樣品的風(fēng)味特征主要取決于烴類(lèi)，其中大部分為萜烯類(lèi)化合物，而3#樣品的風(fēng)味特征主要取決于醛類(lèi)物質(zhì)和雜環(huán)化合物。
　　(4)為區(qū)分不同腌制時(shí)期的四川冬菜樣品，采用E-nose對(duì)不同腌制時(shí)期樣品的風(fēng)味輪廓進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以利用風(fēng)味差異來(lái)判斷四川冬菜的腌制程度;E-nose主要依靠第一組傳感器區(qū)分不同腌制時(shí)期的冬菜樣品，尤其依靠LY2/gCT

13、L、LY2/GH、LY2/AA和LY2/G四個(gè)傳感器進(jìn)行區(qū)分。
　　4.微生物宏基因組分析
　　(1)為深入分析四川冬菜微生物宏基因組注釋信息，分別對(duì)KEGG和eggNOG注釋結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，0#、1#和2#樣品中在KEGG中分別注釋上256、197和215條代謝路徑，其中三個(gè)樣品中同時(shí)注釋上的代謝路徑有178條;注釋到KEGG路徑上的主要微生物為乳桿菌和假單胞菌。0#、1#和2#樣品中通過(guò)eggNOG注釋上的CO

14、G功能分類(lèi)分別有23、20和21類(lèi)，三個(gè)樣品中有20個(gè)功能分類(lèi)都相同。
　　(2)為了研究四川冬菜中微生物與亞硝酸鹽降解之間的關(guān)系，對(duì)亞硝酸鹽降解途徑及其基因注釋結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，與四川冬菜中亞硝酸鹽代謝相關(guān)的微生物有羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）、泊庫(kù)島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)和莫拉鹽單胞菌(Halo

15、monasmaura)。亞硝酸鹽的降解途徑為:1#和2#樣品中，胞外亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)后在還原酶的作用下轉(zhuǎn)變成氨;或者進(jìn)一步在谷氨酰胺合成酶或谷氨酸合成酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０坊蚬劝彼?，再參與到谷氨酸的代謝中，進(jìn)一步在不同酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁帷?-吡咯啉-5-羧酸和磷胺類(lèi)物質(zhì)等，最后又參與到其它代謝途徑中。0#樣品中亞硝酸鹽的代謝除了上述途徑外，還會(huì)在一系列還原酶的作用下降解為一氧化氮和一氧化二氮。
　　(3)為了研究四川冬菜

16、中微生物與氨基酸代謝之間的關(guān)系，對(duì)氨基酸代謝途徑及其基因注釋結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，與四川冬菜中氨基酸代謝相關(guān)的微生物種類(lèi)較為多樣，除了乳桿菌與假單胞菌外，還有其它桿菌、球菌等。微生物主要參與氨基酸降解活動(dòng)，而對(duì)氨基酸合成的貢獻(xiàn)相對(duì)較小;氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化可能是必需氨基酸和非必需氨基酸比例發(fā)生變化的原因之一。
　　(4)為了研究四川冬菜中微生物與顏色之間的關(guān)系，對(duì)可能與顏色代謝相關(guān)的途徑及其基因注釋結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，注

17、釋上的與顏色相關(guān)的微生物僅有門(mén)多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina），出現(xiàn)在0#樣品的KO00860路徑上;在該路徑上，2#樣品比0#和1#樣品中多注釋上一種氧依賴性前卟啉原氧化酶(EC:1.3.3.4)，該酶可以將無(wú)色的原卟啉原IX氧化成紫褐色的原卟啉Ⅸ，這可能是2#冬菜比1#冬菜的顏色看起來(lái)更暗的原因之一。
　　(5)為了研究四川冬菜中微生物與風(fēng)味之間的關(guān)系，對(duì)可能與風(fēng)味相關(guān)的代謝途徑及其基因注釋結(jié)果進(jìn)行了