基于宏基因組序列的黑熊腸道微生物組的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、中藥在我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的地位舉足輕重，《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中明確提出，支持中藥材珍稀瀕危品種保護、繁育和替代品的研究。為開發(fā)名貴中藥熊膽的人工替代品，科技部經(jīng)過反復(fù)考察論證，立項重大新藥創(chuàng)制“體外培育熊膽粉關(guān)鍵技術(shù)及臨床前研究”（2014ZX09301306）。熊膽成分復(fù)雜，其中具有藥學(xué)價值的主要成分為熊去氧膽酸，是通過腸道微生物中7α-羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDH）和7β-羥基類固醇脫氫酶（7β-HSDH

2、），以鵝去氧膽酸為底物轉(zhuǎn)化而來。黑熊作為能夠大量產(chǎn)生熊去氧膽酸的特殊物種，研究其腸道微生物的結(jié)構(gòu)與功能，并挖掘其中酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的7α-/7β-HSDH，具有重要的科學(xué)意義和工業(yè)價值。然而，自然界中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的，動物腸道復(fù)雜的厭氧環(huán)境，更加限制了對其中微生物資源的開發(fā)。
　　對環(huán)境樣品進行宏基因組測序使得我們能夠更快更好地了解其微生物組結(jié)構(gòu)與功能，挖掘其中的功能基因。因此，本文基于宏基因組學(xué)的研究策略，采集來自四川、云南

3、和黑龍江三個地區(qū)黑熊糞便樣品，比較不同地區(qū)黑熊腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)特征，揭示黑熊腸道微生物的共有微生物組成，解析黑熊腸道微生物組的基因功能分布，為認識黑熊腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能提供依據(jù)；在此基礎(chǔ)之上，挖掘并表征黑熊腸道微生物來源的7α-HSDH和7β-HSDH編碼基因，并對得到的7α-/7β-HSDHs進行一系列酶學(xué)性質(zhì)研究，篩選出具有較高活性、較強催化效率和較好熱穩(wěn)定性的7α-/7β-HSDH，為熊去氧膽酸的生物轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)候選酶類

4、，為體外培育熊膽粉的工業(yè)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　?、倩?6S rRNA中V3-V4區(qū)域的序列信息，比較研究四川、云南和黑龍江三地的圈養(yǎng)黑熊腸道微生物菌群組成和結(jié)構(gòu)，共有12個門、192個屬的微生物被鑒定歸類。其中，F(xiàn)irmicutes和Proteobateria是亞洲黑熊腸道菌群的優(yōu)勢菌群，這兩個門的微生物廣泛存在于3個實驗組的所有糞便樣品之中。Clostridium_sensu_stricto_1

5、， Turicibacter，(uncultured） Peptostreptococcaceae Incertae_Sedis， Peptostreptococcaceae Incertae_Sedis， Escherichia-Shigella， Clostridium_glycolicum和Streptococcus這7個屬為三地圈養(yǎng)黑熊的腸道菌群共有微生物；菌群 LefSe分析顯示，各組中差異分布最顯著的3個屬為Escheric

6、hia-Shigella，Streptococcus和Pseudomonas；Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析一致表明，四川和云南的圈養(yǎng)黑熊腸道微生物菌群類似，在組成和結(jié)構(gòu)上無明顯差別，而黑龍江的圈養(yǎng)黑熊具有更加豐富的菌群多樣性，在組成和結(jié)構(gòu)上與先前兩地有明顯差異，提示生物地理學(xué)等因素可能對亞洲黑熊的腸道微生物組成產(chǎn)生影響。上述結(jié)果為認識黑熊腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及其特征提供依據(jù)。
　　②通過宏基因組學(xué)的研究方法，對來自四川、

7、云南和黑龍江的3個黑熊糞便樣品進行高通量測序，揭示黑熊腸道微生物組中的功能特征和代謝途徑。對序列進行拼接、組裝和預(yù)測后，一共得到400118個 ORFs，是一個巨大的微生物基因資源寶庫?；?COG數(shù)據(jù)庫的功能注釋表明，黑熊腸道基因組中富含涉及Metabolism的功能基因，其中碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝基因和氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝基因這兩類含量最高；基于NR基因物種分類表明，3個樣品中測序所得ORF基因大多來自Firmicutes；KEGG代謝網(wǎng)

8、絡(luò)顯示，黑熊糞便宏基因組中存在豐富的碳代謝、核酸代謝和氨基酸代謝通路。上述研究為理解黑熊腸道微生物菌群功能提供一定的理論參考，也為下一步挖掘其中的新穎生物催化劑提供了數(shù)據(jù)平臺。
　?、鄄捎帽镜?BLAST對比策略，從上述所得黑熊腸道宏基因組中挖掘、克隆putative7α-/7β-HSDH編碼基因，體外表達后表征催化功能，并對蛋白序列進行生物信息學(xué)分析。共有38個putative7α-HSDH編碼基因和10個putative7β-

9、HSDH編碼基因被發(fā)現(xiàn)，克隆并表達了其中具有全長序列的5個7α-HSDH編碼基因和1個7β-HSDH編碼基因；與課題組前期用于熊去氧膽酸生物轉(zhuǎn)化的、Clostridium absonum ATCC27555來源的7α-HSDH（Clo.sa-a）和7β-HSDH（Clo.sa-b）酶活比較顯示，黑熊腸道微生物組來源的7α-HSDH蛋白S1-a-1和S1-a-2顯示出優(yōu)越的催化活性，顯著高于Clo.sa-a，黑熊腸道微生物組來源的7β-H

10、SDH蛋白Y1-b-1也表現(xiàn)出良好的催化活性，與Clo.sa-b酶活相當；6個重組蛋白所催化的酶促反應(yīng)產(chǎn)物HPLC檢測再次表明，使用宏基因組技術(shù)挖掘putative7α-HSDH和7β-HSDH的策略有效可行；蛋白同源性分析及氨基酸序列對比結(jié)果顯示出6個HSDH蛋白較高的同源性及保守的SDR超家族蛋白序列特征。
　?、軐谛苣c道微生物組來源于的7α-/7β-HSDHs酶學(xué)性質(zhì)進行了較為系統(tǒng)的研究，并比較了它們與Clo.sa-a和C

11、lo.sa-b在酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)和熱穩(wěn)定性這兩方面的差異。蛋白S1-a-1催化效率顯著高于其它7α-HSDHs，是Clo.sa-a的10倍，Y1-b-1與Clo.sa-b催化效率相當；在實驗條件下，6個HSDH蛋白的最適pH均為堿性，集中在7.5-9.0之間，最適溫度集中在30-50C之間；酶的熱穩(wěn)定性實驗顯示，5個7α-HSDH的熱穩(wěn)定性與Clo.sa-a相當，而Y1-b-1熱穩(wěn)定性優(yōu)于Clo.sa-b，特別是在37C條件下，其熱穩(wěn)定性