三種外源代謝物對提高耐藥副溶血性弧菌藥物敏感性的機理研究.pdf

1、我國是抗菌藥物的生產和使用大國。抗菌藥物廣泛應用于醫(yī)療衛(wèi)生、農業(yè)養(yǎng)殖領域，在治療感染性疾病挽救患者生命、防治動物疫病提高養(yǎng)殖效益以及保障公共衛(wèi)生安全中，發(fā)揮了重要作用。但是，由于新型抗菌藥物研發(fā)能力不足、藥店無處方銷售抗菌藥物、醫(yī)療和養(yǎng)殖領域不合理應用抗菌藥物、制藥企業(yè)廢棄物排放不達標、群眾合理用藥意識不高等多種因素，細菌耐藥問題日益突出。
　　副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌。弧菌可感染的宿主范圍極廣包括魚和甲殼類在內的經(jīng)濟水

2、產動物，同時也是引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，是我國沿海地區(qū)食源性疾病的主要病原菌。目前，使用抗菌藥物仍然是控制和治療弧菌病的主要手段，抗生素的過度使用也導致了副溶血性弧菌的耐藥性不斷增強。近年來，有研究表明外源添加小分子代謝物可以增強耐藥遲鈍愛德華氏菌對氨基糖類抗生素的敏感性。(1)本研究近一步比較了三種外源物質（葡萄糖、丙氨酸、甘油）對增強副溶血性弧菌抗生素敏感性的作用效果，并采用電子傳遞鏈抑制劑CCCP對表型實驗結果進行初步驗證

3、。(2)基于定量蛋白質組學 ITRAQ技術，深入研究細胞代謝微環(huán)境與菌體藥物敏感性變化機制，為后續(xù)復合型抗生素試劑的開發(fā)奠定理論研究基礎。(3)在基因水平上對蛋白質組學中感興趣的差異蛋白表達量進行驗證。通過數(shù)據(jù)分析初步表明外源代謝物可通過底物激活，加強菌體細胞內氧化磷酸化水平，顯著提高了質子驅動力(Proton motive force，PMF)以及跨膜初級鈉泵離子通道草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase

4、）含量共同促進胞外氨基糖苷類抗生素跨膜運輸，從而有效提高了耐藥副溶血性弧菌細胞內氨基糖苷類抗生素的有效濃度，提高了細菌對亞抑菌濃度抗生素的敏感性，具有一定的實際應用價值。
　　1.三種外源代謝物對增強副溶血性弧菌抗生素敏感性作用效果的比較
　　本實驗在基于耐藥代謝狀態(tài)以及利用原有抗生素來防治多重耐藥細菌研究成果的基礎上，進一步探究比較了在亞抑菌濃度卡那霉素脅迫條件下，外源添加糖、脂、氨基酸對增強副溶血性弧菌藥物敏感性作用效果

5、的影響。實驗結果顯示，耐藥弧菌在分別添加終濃度為10 mM葡萄糖、丙氨酸、甘油后于37℃培養(yǎng)6h，其對1/8MIC卡那霉素藥物敏感性分別提高了27000倍，3228倍，102倍。其中以葡萄糖為代表糖代謝途徑對提高耐藥細菌恢復作用效果較為顯著，氨基酸代謝次之，脂質代謝則對能量代謝通路調控能力較弱。并通過偶聯(lián)劑CCCP對上述實驗結果進行了驗證。CCCP消除了由外源代謝物代謝所產生的質子跨膜梯度，導致外源代謝物的添加失去作用。通過表型實驗初步

6、表明外源代謝物可通過促進氧化磷酸化及跨膜質子動力勢產生，刺激了菌體對胞外氨基糖苷類抗生素的吸收。后續(xù)進一步的作用機制將在蛋白網(wǎng)絡水平上對細菌細胞代謝狀態(tài)水平的變化進行深入闡釋和驗證。
　　2.基于定量蛋白質組學ITRAQ闡釋外源代謝物對增強副溶血性弧菌抗生素敏感性作用機理研究
　　本次實驗首次運用定量蛋白質組學技術深入分析了三種外源代謝物對提高副溶血性弧菌藥物敏感性的作用機制。ITRAQ共鑒定出了178個差異蛋白。其中顯著表

7、達上調蛋白質（P＜0.05, ratio＞1.5）71個，顯著表達下調蛋白質（P＜0.05, ratio＜0.75）107個。顯著的差異代謝通路主要集中在細菌的能量代謝通路、跨膜蛋白轉運體和陽離子通道、信號轉導、DNA損傷修復及細胞凋亡等相關生物過程。其中糖代謝通路上丙酮酸脫氫酶PDH、檸檬酸合酶 GltA、酮戊二酸脫氫酶復合體-亞基 OGD、琥珀酰輔酶合成酶β亞基SucC、琥珀酸脫氫酶SDH表達量均有明顯提高。氨基酸代謝通路富集到的差

8、異主要集中在天冬氨酸-精氨酸合成代謝、甘氨酸和丙氨酸等代謝通路。已知氨基酸代謝在調控胞內 pH,產生代謝能量或還原力以及調節(jié)胞內微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有重要作用，而無氧呼吸過程相關的乳糖代謝通路中關鍵酶乳糖脫氫酶和細胞分裂因子則受到顯著抑制。其中有趣的是草酰乙酸脫羧酶作為主要的初級Na+泵離子通道其含量發(fā)生顯著的變化。草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase，Oad）是一個多酶復合體，由α亞基（OadA,63-65K

9、Da）,β亞基（OadB,40-45Kda），γ亞基（OadG,9-10KDa）組成，該多酶復合體三個亞基蛋白表達量均顯著上調，從差異蛋白交互作用分析得出草酰乙酸脫氫酶作為嗜鹽菌中重要的陽離子跨膜通道（嗜鹽菌中重要的物質運輸交換通道之一），其活性亞基 OadG與糖酵解中關鍵限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶pckA互作關聯(lián)緊密，與天冬氨酸與精氨酸合成代謝以及引發(fā)SOS易錯修復阻遏蛋白lexA和主要的DNA修復酶—DNA聚合酶IV dinB存在

10、顯著的互作關系，該酶氧化脫酸產物α-酮戊二酸可進入菌體主要能量代謝通路檸檬酸循環(huán)，水解產生的能量可促使胞內Na+外排產生的陽離子動力勢促進胞外溶質的吸收。從通路富集結果猜測嗜鹽類海洋弧菌可通過氧化磷酸化產生的質子動力勢并偶聯(lián)草酰乙酸多酶復合體組成的初級鈉泵離子通道促進胞外氨基糖苷類抗生素的跨膜運輸，有效提高了胞內抗生素的有效濃度。為殺死多藥耐藥副溶血性弧菌提供了新思路，也為復合型抗生素新藥開發(fā)奠定了理論基礎。
　　3.基因水平上對