昆蟲血細(xì)胞通過表達(dá)cathepsin L參與脂肪體的降解.pdf

1、研究背景及研究意義：
　　 全變態(tài)昆蟲的一生要經(jīng)歷多次蛻皮，包括幼蟲各齡期之間的蛻皮、末齡幼蟲到蛹的變態(tài)蛻皮、以及蛹到成蟲的羽化蛻皮。昆蟲蛻皮和變態(tài)主要受兩種激素的調(diào)控:蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenilehormone，JH)。這兩種激素相互作用，共同決定著昆蟲不同發(fā)育階段生理活動(dòng)和形態(tài)變化。在沒有JH存在的情況下，20E啟動(dòng)變態(tài)過程。在變態(tài)過程中，幼蟲的組織發(fā)生降解，而成蟲的組

2、織逐漸形成。在幼蟲組織降解過程中發(fā)現(xiàn)了血細(xì)胞的參與，但血細(xì)胞如何影響組織降解卻并不清楚。闡明血細(xì)胞與變態(tài)期幼蟲組織水解的關(guān)系，并探索血細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白cathepsinL的功能，可以闡明血細(xì)胞在變態(tài)期組織重建中的作用及機(jī)理。
　　 研究進(jìn)展：
　　 昆蟲的血細(xì)胞被認(rèn)為主要參與免疫反應(yīng)，包括在病原微生物周圍形成包囊和結(jié)節(jié)以及吞噬病原微生物，清除外源物質(zhì)，然而也有報(bào)道表明血細(xì)胞可以在昆蟲的生長發(fā)育以及變態(tài)過程的組織重建中

3、發(fā)揮重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L在血細(xì)胞中特異表達(dá)，并在變態(tài)時(shí)期高表達(dá)，受蛻皮激素上調(diào)。在棉鈴蟲幼蟲進(jìn)行RNA干擾沉默cathepsinL之后，導(dǎo)致循環(huán)的顆粒細(xì)胞減少，脂肪體中沒有顆粒細(xì)胞進(jìn)入而不能降解，形成不正常的嵌合蛹，提示20E促進(jìn)cathepsinL在血細(xì)胞中表達(dá)從而參與組織解體。
　　 存在的科學(xué)問題：
　　 雖然前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20E促進(jìn)cathepsinL表達(dá)，決定顆粒細(xì)胞數(shù)量、進(jìn)而決定

4、脂肪體降解，但cathepsinL在顆粒細(xì)胞中的功能及作用機(jī)理不清楚，干擾cathepsinL導(dǎo)致顆粒細(xì)胞減少的原因尚不清楚，血細(xì)胞進(jìn)入脂肪體以及在脂肪體解體中的作用機(jī)理也需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 研究結(jié)果：
　　 針對存在的科學(xué)問題，本論文運(yùn)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)開展研究，取得如下結(jié)果：
　　 1.通過細(xì)胞形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞在變態(tài)過程中會(huì)發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞數(shù)量增加，體積增大，且所含顆粒數(shù)

5、目增多，轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細(xì)胞。與此同時(shí)，漿血細(xì)胞的數(shù)量急劇減少。
　　 2.利用Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)cathepsinL在蛻皮變態(tài)過程中表達(dá)量顯著增加。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示cathepsinL主要定位于顆粒細(xì)胞和漿血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
　　 3.通過血細(xì)胞進(jìn)體外培養(yǎng)的方法，證明20E可以促進(jìn)漿血細(xì)胞的鋪展，促進(jìn)顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細(xì)胞并遷移粘附到鋪展的漿血細(xì)胞上。Westernblot顯示20E同時(shí)使cathepsi

6、nL上調(diào)表達(dá)。
　　 4.運(yùn)用RNAi在體外培養(yǎng)的血細(xì)胞中干擾cathepsinL，導(dǎo)致大多數(shù)顆粒細(xì)胞漂浮死亡在培養(yǎng)液中，不能形成大顆粒細(xì)胞。同時(shí)漿血細(xì)胞的鋪展也受到了抑制。
　　 5.通過活細(xì)胞熒光標(biāo)記血細(xì)胞后重新注射到蟲體內(nèi)，證明血細(xì)胞可以進(jìn)入變態(tài)期的幼蟲脂肪體中，使脂肪體降解和水解。
　　 6.通過在棉鈴蟲表皮細(xì)胞系中過表達(dá)cathepsinL的蛋白酶功能域，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說明cathepsi

7、nL可通過蛋白酶活性參與脂肪體降解。
　　 7.變態(tài)時(shí)期血細(xì)胞凋亡率明顯增加，且凋亡細(xì)胞主要為顆粒細(xì)胞。
　　 8.CathepsinL可以在6th-96h和6th-120h幼蟲的血漿和脂肪體中檢測到，說明凋亡細(xì)胞可能將cathepsinL釋放到血漿中，并參與脂肪體的降解。
　　 結(jié)論及意義：
　　 本研究證明了棉鈴蟲顆粒細(xì)胞在變態(tài)時(shí)期數(shù)量增加并轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細(xì)胞;cathepsinL在變態(tài)期高表達(dá)，主要分

8、布在顆粒細(xì)胞及漿血細(xì)胞中;20E促進(jìn)cathepsinL表達(dá)和顆粒細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化;干擾cathepsinL之后導(dǎo)致20E激素不能促進(jìn)顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細(xì)胞而死亡;變態(tài)時(shí)期的血細(xì)胞可以進(jìn)入到幼蟲脂肪體中;棉鈴蟲表皮細(xì)胞系中過表達(dá)cathepsinL可以引起細(xì)胞凋亡;變態(tài)時(shí)期血細(xì)胞凋亡率增加，;凋亡的血細(xì)胞可以釋放cathepsinL到血漿中參與組織的降解。
　　 本研究闡明了血細(xì)胞在昆蟲變態(tài)過程的組織重建中發(fā)揮作用，其作用機(jī)理是