基于化學(xué)生物學(xué)方法結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)的中藥藥效物質(zhì)快速篩選方法研究.pdf

1、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥作用機(jī)理探討、創(chuàng)新藥物研制和建立與藥效相關(guān)的中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代化研究中的重中之重。而中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的核心內(nèi)容，建立中藥藥效物質(zhì)的快速篩選方法對(duì)中藥現(xiàn)代化研究具有重要的推動(dòng)作用。本文聚焦于中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)方法的技術(shù)性問題，著重研究基于化學(xué)生物學(xué)方法結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)的中藥藥效物質(zhì)快速篩選新方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴建立HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS方

2、法對(duì)養(yǎng)心氏片的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，共鑒定了其中127個(gè)化合物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分類和質(zhì)譜裂解規(guī)律的解析。采用DPPH-LC-MS分析技術(shù)對(duì)養(yǎng)心氏片中的抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)作了進(jìn)一步的研究，從中快速篩選到34個(gè)潛在的抗氧化成分。其中丹酚酸A和丹酚酸B為最強(qiáng)的抗氧化物質(zhì)，其DPPH自由基清除活性高于VC。通過對(duì)大鼠口服養(yǎng)心氏片的入血成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A和丹酚酸B可以入血，可能是養(yǎng)心氏片發(fā)揮體內(nèi)抗氧化作用的重要藥效物質(zhì)。⑵創(chuàng)新性地提出了一

3、種血腦屏障人造膜平行性透過試驗(yàn)與DPPH探針識(shí)別相結(jié)合的PAMPA-BBB-DPPH方法，并將其應(yīng)用于中藥中可透過血腦屏障的抗氧化物質(zhì)篩選。發(fā)現(xiàn)知母乙酸乙酯提取物為活性中藥提取物。通過DPPH-HPLC結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，鑒定出知母提取物中的可透過血腦屏障的抗氧化物質(zhì)為2，6，4'-Trihydroxy-4-methoxybenzophenone。體外研究表明，該物質(zhì)具有中等強(qiáng)度的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力略弱于VC等抗氧化劑

4、，但是其血腦屏障人造膜透過能力很強(qiáng)，具有深入開發(fā)為腦保護(hù)藥物的價(jià)值。⑶將親和超濾LC-MS方法與分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合，首次應(yīng)用于中藥注射劑與人血清白蛋白相互作用的研究。發(fā)現(xiàn)丹紅注射液中的丹酚酸類成分有很強(qiáng)的人血清白蛋白結(jié)合作用，且與聯(lián)用藥阿司匹林的主要代謝產(chǎn)物水楊酸存在競(jìng)爭(zhēng)作用。通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)、分子對(duì)接、結(jié)合位點(diǎn)探針替代試驗(yàn)等方法解釋了其競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。研究?jī)?nèi)容為丹紅注射液與人血清白蛋白的相互作用研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為中藥注射劑與人血清白

5、蛋白的相互作用研究提供了新的思路。⑷提出一種基于固定化融合靶點(diǎn)親和色譜的親和選擇方法，將其應(yīng)用于PPARγ配體的篩選。通過基因工程技術(shù)將靶點(diǎn)受體與親和標(biāo)簽融合，可以實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)蛋白的快速制備、定向固定及純化，從而應(yīng)用于天然產(chǎn)物中相應(yīng)配體的篩選。相比于之前報(bào)道的親和選擇篩選方法，可低成本地獲得大量靶點(diǎn)蛋白，實(shí)現(xiàn)快速、定向的靶點(diǎn)固定，并能提高篩選通量。應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)野菊花中的異綠原酸A具有較強(qiáng)的PPARγ結(jié)合能力。該研究為親和選擇方法的建立提供