基于功能核酸和發(fā)光納米材料的熒光探針的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、隨著熒光技術(shù)的不斷發(fā)展，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速并可實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)的熒光探針在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域的研究也取得了較大的發(fā)展，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。利用熒光探針監(jiān)測(cè)生命活動(dòng)相關(guān)的物質(zhì)，對(duì)疾病的早期診斷和治療具有非常重要的意義。雖然傳統(tǒng)熒光探針技術(shù)經(jīng)過不斷地發(fā)展和完善，在生化分析領(lǐng)域得到了廣泛地應(yīng)用，但是其具有的靈敏度與選擇性有限、耐光漂白能力差、進(jìn)入細(xì)胞效率低、細(xì)胞或組織自身熒光干擾大以及組織穿透深度小等缺點(diǎn)在很大程

2、度上限制了熒光探針在生物體內(nèi)的應(yīng)用。為了更好地滿足生物分析實(shí)際應(yīng)用的需求，發(fā)展性質(zhì)優(yōu)良的熒光探針仍然是科學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　近年來，各種新型納米材料及新熒光技術(shù)為解決上述問題提供了可能。其中，功能核酸的出現(xiàn)，為提高熒光探針的靈敏度、選擇性提供了新的途徑。由于其合成和修飾簡(jiǎn)單、與靶標(biāo)結(jié)合力強(qiáng)、選擇性好、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)。功能核酸主要包括兩大類能夠與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸分子，分別是具有類似蛋白酶催化活性、高度

3、依賴輔因子的脫氧核酶(DNAzyme)和具有與抗體性質(zhì)類似、能與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體（Aptamer）。此外，發(fā)光硅納米顆粒、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換顆粒等發(fā)光納米材料，由于其發(fā)光性能好、細(xì)胞穿透能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易修飾等優(yōu)點(diǎn)，可以作為熒光探針信號(hào)基團(tuán)用于生物檢測(cè)，也可以作為載體用于藥物或成像試劑的輸送。另外，為了解決傳統(tǒng)熒光探針易光漂白、生物組織穿透深度淺及生物自發(fā)熒光干擾大等問題，新興的雙光子熒光成像技術(shù)利用低能量的近紅外光作為激發(fā)

4、光源，不僅可以減小激發(fā)光對(duì)熒光物質(zhì)的光漂白作用，而且可提高激發(fā)光對(duì)生物樣品的穿透深度，能夠?qū)崿F(xiàn)深層組織中的檢測(cè)和成像，并且能有效地避免生物樣品自發(fā)熒光的干擾，在復(fù)雜生物樣品分析及活體成像中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　本論文利用功能核酸及發(fā)光納米材料的特點(diǎn)，結(jié)合雙光子熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了一系列新型的靈敏度高、選擇性好的熒光納米探針，并成功將其應(yīng)用于與生命活動(dòng)密切相關(guān)的離子、小分子等目標(biāo)物的定量檢測(cè)。具體內(nèi)容如下:
　　(1

5、)在第2章中，我們利用T4 DNA連接酶對(duì)ATP的高度依賴性和E.ColiDNA連接酶對(duì)NAD+的高度依賴性，選用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物作為質(zhì)量放大器，分別構(gòu)建了選擇性好、靈敏度高的熒光各向異性分析法探針。所得熒光探針能有效地區(qū)分ATP和其類似物（AMP和ADP），或者NAD+和其類似物(NADH)，其檢測(cè)限分別是50 nM和10 nM，均低于類似方法的文獻(xiàn)報(bào)道值。
　　(2)在第3章中，我們利用脫氧核酶的識(shí)別和信號(hào)放大功能，結(jié)

6、合銀納米簇的優(yōu)良光學(xué)特性，開發(fā)了非標(biāo)記的熒光探針分別用于鉛離子以及L-組氨酸的檢測(cè)。脫氧核酶對(duì)其輔因子具有非常高的依賴性和選擇性，能特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子，激活酶活性。激活后的脫氧核酶將底物鏈切割成兩部分后，釋放出來的富G部分結(jié)合作為熒光信號(hào)報(bào)告基團(tuán)的銀納米簇，使熒光得到增強(qiáng)。同時(shí)，脫氧核酶的循環(huán)作用實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，大大提高了對(duì)pb2+以及L-組氨酸的檢測(cè)靈敏度。
　　(3)基于雙光子成像技術(shù)激發(fā)光源組織穿透深度大、對(duì)樣品損傷

7、小、背景熒光干擾小等優(yōu)點(diǎn)，在第4章中，我們合成了對(duì)HOCl特異性響應(yīng)的雙光子金納米簇(AuNCs)，并提出了一種具有高選擇性、高靈敏度的比率型雙光子熒光納米探針用于細(xì)胞中HOCl的檢測(cè)。雙光子內(nèi)參的設(shè)計(jì)，有效消除了環(huán)境因素的干擾，提高了探針對(duì)HOCl檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
　　(4)第5章中我們結(jié)合雙光子納米顆粒(TPNPs)和CoOOH納米片，成功構(gòu)建了雙光子熒光納米探針(TPNPs@CoOOH)用于細(xì)胞中抗壞血酸的高靈敏度檢測(cè)。該雙光

8、子納米粒子表現(xiàn)出對(duì)抗壞血酸(AA)的高靈敏度，檢測(cè)限(LOD)可達(dá)170 nM。其優(yōu)良的細(xì)胞膜穿透性和良好的生物相容性有利于深層組織中AA的雙光子熒光成像研究。
　　(5)在第6章中，利用人血清白蛋白在癌細(xì)胞表面富集的被動(dòng)靶向作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種可對(duì)耐藥性癌細(xì)胞進(jìn)行基因治療和化療的多功能納米顆粒。該納米顆粒攜帶的三種DNA能有效抑制耐藥性癌細(xì)胞中MRP1 mRNA，MDR1 mRNA，Bcl2 mRNA的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白