基于聚集誘導發(fā)光原理的熒光納米探針制備及其生物傳感和成像應用.pdf

1、熒光探針已成為了分析傳感和光學成像的有力工具。它在分子水平上可以對復雜的生物結(jié)構(gòu)和過程進行可視化分析。傳統(tǒng)的染料大多數(shù)在高濃度時會熒光會減弱，甚至不發(fā)光，稱為聚集誘導淬滅效應。直到2001年，唐本忠教授課題組發(fā)現(xiàn)了另一種現(xiàn)象的染料分子，在聚集狀態(tài)時，熒光強度會大大增強，這種現(xiàn)象稱為聚集誘導發(fā)光效應效應。基于聚集誘導發(fā)光分子的生物檢測方法，與基于傳統(tǒng)染料的檢測方法相比，它可以對水溶液中特定的分析物或生物過程直接地可視化檢測，并且具有更高的

2、靈敏度。本論文合成了三種發(fā)不同顏色熒光的聚集誘導發(fā)光分子，并通過共價鍵與功能核酸分子連接，開發(fā)出新的生物傳感探針，并將其應用在體外檢測早期腫瘤標志物及用于活細胞成像。本論文的主要內(nèi)容包括四個方面：
　　(1)設(shè)計了一種高靈敏度的檢測miR-21的方法。實驗中用到的探針合成，只修飾了熒光團，沒有修飾其它淬滅基團，這樣可以簡化熒光基團和淬滅基團之間合適距離精確設(shè)計的復雜過程。此外，通過調(diào)節(jié)反應溫度可以提高miR-21檢測限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

3、反應溫度為4oC時，檢測限可以達到10aM，相當于在50μL體積內(nèi)有約300個分子。接著，將此檢測手段應用于臨床樣品的檢測，成功地檢測出21個膀胱癌患者的尿樣本。
　　(2)合成了一種發(fā)射黃色熒光的AIE分子，并將其修飾在DNA上，得到另一復合探針TPEPy-LDNA。利用該探針可以區(qū)分癌癥患者的尿液樣本和正常人的尿液樣本，同時，分別對乳腺癌細胞（MCF-7）、宮頸癌細胞（HeLa）和人胚肺成纖維細胞（HLF）三種細胞內(nèi)熒光成像，

4、同時設(shè)計了另外兩種修飾傳統(tǒng)染料的探針作為對照組，分別是FAM-LDNA探針和Cy3-MBDNA探針。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MCF-7細胞內(nèi)的熒光強度最大，因為MCF-7細胞內(nèi)miR-21的表達量比其它兩種細胞的高。接著利用該探針對MCF-7細胞內(nèi)miR-21長時間成像示蹤，從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用TPEPy-LDNA探針對細胞成像，隨著時間增加，熒光強度增強，說明了該探針染料分子具有很強的抗光漂白能力。FAM-LDNA探針的光漂白現(xiàn)象最嚴重，熒光一直在

5、減弱，甚至最后會消失，不適合在細胞內(nèi)長時間熒光示蹤。
　　(3)設(shè)計出一種1：N2的信號放大的策略，Exo III作為信號放大器，可以高靈敏地檢測端粒酶活性。在端粒酶催化下，重復單位（TTAGGG）n在引物的3’端依次延長，同時，TPE-Py-DNA探針中的DNA會與重復單元雜交形成雙鏈，此時Exo III會催化水解探針中DNA部分，釋放出疏水的TPE-Py分子，TPE-Py-DNA探針會與解離出來的重復單元和再次延長的重復單元雜

6、交形成雙鏈，開始第二個周期，依次循環(huán)下去，疏水的TPE-Py分子會聚集在一起，產(chǎn)生與端粒酶活性有關(guān)的熒光信號，最后，可以達到目標-信號（target-to-signal）1:N2的放大比率。該方法可以用來監(jiān)測不同的細胞系（包括Hela、乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、MCF-7、人皮膚黑色素瘤細胞（A375）、HLF和人胚肺成纖維細胞（MRC-5））的端粒酶活性變化，同時用來檢測臨床尿液樣本，得到了表現(xiàn)出良好的結(jié)果，可區(qū)分15例癌癥

7、病人的樣本和8例健康人的尿液樣品。
　　(4)成功地合成一種發(fā)紅色光的AIE分子，并將該分子通過點擊反應與DNA相連，得到復合探針TPE-R-DNA，成功應用于細胞成像。MCF-7細胞中mRNA表達量大于HeLa細胞的，實驗發(fā)現(xiàn)在MCF-7細胞中的熒光強度明顯高于HeLa細胞。同時利用蟲草素和脂多糖（LPS）分別下調(diào)和上調(diào)MCF-7細胞內(nèi)mRNA的表達量時，可以從細胞熒光強弱可以觀察出細胞內(nèi)mRNA表達量的變化，對研究生物過程和疾