董酒釀造過程中不飽和脂肪酸形成機理的研究.pdf

1、本論文主要從董酒大、小酒曲中各自分離及篩選出一株細(xì)菌、一株酵母菌、一株霉菌，實驗以蛋白酶，發(fā)酵力，糖化酶作為細(xì)菌、酵母菌、霉菌各自的篩選指標(biāo)。設(shè)計實驗對篩選出來的三大類菌株，分別進(jìn)行自身基因組中脂肪酸脫氫酶基因片段的檢測，從酒曲微生物基因片段的角度初步分析釀造過程中微生物對不飽和脂肪酸形成的貢獻(xiàn)作用。在分別對三類菌株進(jìn)行純種液態(tài)發(fā)酵，設(shè)立實驗組（分別添加大、小酒曲浸提液）和空白組（不添加）開展實驗，取發(fā)酵液每天進(jìn)行氣相色譜（GC）跟蹤分

2、析測試，分析發(fā)酵液中5種不飽和脂肪酸含量的變化情況。最后進(jìn)行混菌液態(tài)發(fā)酵，利用Kriging代理模型來優(yōu)化混菌接種比例，用最終優(yōu)化的混菌比例液態(tài)發(fā)酵與國密系列成品董酒對比分析兩者中5種不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸）含量的差異性，從而總結(jié)釀造過程中不飽和脂肪酸形成的機理。
　　以董香型的大、小酒曲為研究材料并分別從兩者中分離、篩選及鑒定出各一株細(xì)菌，酵母菌及霉菌。通過稀釋涂布平板法和平板劃線法等傳統(tǒng)微

3、生物分離方法分別對大、小曲細(xì)菌、酵母菌、霉菌進(jìn)行分離。然后，用透明圈染色法分別對細(xì)菌、霉菌進(jìn)行初步篩選。通過對細(xì)菌測定蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力進(jìn)行復(fù)篩。分別從大、小曲中各選出一株細(xì)菌，分別命名為DX-2、XX-2。對霉菌測定其糖化酶、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力進(jìn)行復(fù)篩。分別從大、小曲中各選出一株霉菌，分別命名為DM-4、XM-4。用TTC染色法對酵母菌進(jìn)行初篩，然后測定發(fā)酵物的酒精度、CO2總失重、總酸、總酯等指標(biāo)來進(jìn)行復(fù)篩。最終分別

4、從大、小曲中各選出一株酵母菌，分別命名為DJ-5、XJ-4。通過形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，判定DX-2屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌屬，XX-2屬于蠟樣芽胞桿菌屬。DM-4屬于米根霉屬，XX-2屬于斜臥青霉屬。DJ-5、XJ-4均屬于異常威克漢姆酵母菌屬。
　　闡述了目前不飽和脂肪酸形成的途徑機理的兩種學(xué)說，以傳統(tǒng)途徑中的關(guān)鍵酶——脂肪酸脫氫酶為依據(jù)。以篩選出來的細(xì)菌 DX-2、XX-2，酵母菌 DJ-5、XJ-4，霉

5、菌 DM-4、XM-4為對象，送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行各目的菌株的脂肪酸脫氫酶基因片段 PCR擴增實驗，分析目的菌株各自基因組中是否存在脂肪酸脫氫酶的基因片段。擬從董酒釀造過程中的酒曲微生物為研究對象分析其基因組中的脂肪酸脫氫酶基因片段，結(jié)合基因的角度來一并分析董酒在釀造過程中微生物產(chǎn)生不飽和脂肪酸的合成機理。從 PCR擴增結(jié)果表明，酵母菌和霉菌都分別存在脂肪酸脫氫酶的某一類基因，初步判定它們存在合成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶

6、，而篩選出的細(xì)菌因無法合成適當(dāng)?shù)囊?，而不能判定，直接進(jìn)行后期的液態(tài)發(fā)酵。
　　利用篩選出來的細(xì)菌（DX2、XX2）、酵母菌（DJ5、XJ4）、霉菌（DM4、XM4）分別進(jìn)行純種液態(tài)發(fā)酵。分為實驗組（分別為大曲浸提液組、小曲浸提液組）和空白組（不添加）同時進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵周期為10天，每天取相應(yīng)的發(fā)酵液進(jìn)行GC分析跟蹤測試。通過分析測定發(fā)現(xiàn)，各菌株液態(tài)發(fā)酵時可在發(fā)酵期的第6天或7天達(dá)到5種不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞

7、油酸、α-亞麻酸）含量的最大值，從第8天開始各種不飽和脂肪酸含量開始呈現(xiàn)下降趨勢。整體來看，每個菌株的實驗組均比對應(yīng)的空白組不飽和脂肪酸含量相對較高。通過對 GC分析綜合來看，在細(xì)菌中選取 DX2、酵母中選取 XJ4、霉菌中選取XM4來進(jìn)行后面的混菌液態(tài)發(fā)酵。
　　通過純種液態(tài)發(fā)酵選取出來的菌株進(jìn)行混菌液態(tài)發(fā)酵。營造白酒釀造過程中的微生物混菌環(huán)境。利用kriging代理模型來優(yōu)化混菌比例，通過建立的模型優(yōu)化找到幾組預(yù)測混菌比例，將

8、得到的預(yù)測比例進(jìn)行驗證實驗，最終選取得到混菌比例中的各不飽和脂肪酸含量與預(yù)測值中的含量進(jìn)行相對誤差偏差計算，誤差控制在低于10％內(nèi)，便說明此方法成立，優(yōu)化可行。通過建模優(yōu)化，最終確立V細(xì):V酵:V霉=1.9:1.9:6.2, V細(xì):V酵:V霉=2.0:4.9:3.1分別為大、小曲浸提液實驗組的最終優(yōu)化結(jié)果。通過最終優(yōu)化的結(jié)果發(fā)酵，取液態(tài)發(fā)酵7天后的液體與國密系列成品董酒進(jìn)行氣相色譜分析，測定了5種不飽和脂肪酸甲酯化后的含量，結(jié)果表明發(fā)酵