沙丁胺醇和多效唑免疫分析方法的基礎(chǔ)研究.pdf

1、免疫分析方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，為環(huán)境中農(nóng)獸藥殘留的快速分析提供了一種可靠的分析方法。本研究以沙丁胺醇和多效唑?yàn)檠芯繉?duì)象，分別建立了兩種藥物的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法（ic-ELISA）和時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）。
　　以沙丁胺醇琥珀酸酐和多效唑琥珀酸酐作為兩種藥物的半抗原，采用碳二亞胺法（DCC/NHS體系）分別將半抗原與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)得到免疫原，采用碳二亞胺法（EDC

2、/NHS體系）分別將半抗原與卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)得到包被原，利用紫外光譜分析證明偶聯(lián)成功。沙丁胺醇的免疫原和包被原的偶聯(lián)比分別是11:1和7:1，多效唑的免疫原和包被原的偶聯(lián)比分別是12:1和8:1。用免疫原免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體，當(dāng)沙丁胺醇和多效唑的包被原濃度為4 mg/L時(shí)，兩者的抗體血清的效價(jià)分別是4.0×104和6.4×105。
　　通過(guò)對(duì)ic-ELISA檢測(cè)體系影響因素（有機(jī)溶劑、Na+強(qiáng)度和pH）的優(yōu)化，得

3、到沙丁胺醇ic-ELISA法的最優(yōu)條件：甲醇含量為10％，Na+強(qiáng)度為0.2 mol/L，pH為7.5。在最佳工作條件下，對(duì)沙丁胺醇ic-ELISA法的靈敏度、特異性和精密度進(jìn)行研究。該方法的IC50為0.43μg/L，LOD為0.0056μg/L，線性范圍為0.04-3.85μg/L。抗體對(duì)萊克多巴胺沒有明顯的交叉，而對(duì)鹽酸克倫特羅的交叉反應(yīng)率達(dá)到68.7%。在河水和豬尿樣品中的平均回收率介于93.98%-107.66%，變異系數(shù)介于

4、2.04%-7.43%。同樣的對(duì)沙丁胺醇TRFIA檢測(cè)體系進(jìn)行條件優(yōu)化，其最優(yōu)條件分別為：包被原為1.0 mg/L，多克隆抗體稀釋40000倍，Eu3+-二抗稀釋2000倍，甲醇含量為10%，Na+強(qiáng)度為0.2 mol/L，pH為7.5。該方法的IC50為0.11μg/L，LOD為0.66 ng/L，線性范圍是0.004-5.02μg/L。對(duì)鹽酸克倫特羅的交叉反應(yīng)是44%，對(duì)萊克多巴胺沒有明顯的交叉反應(yīng)。在河水和豬尿樣品中的平均回收率介

5、于86.98%-106.75%，變異系數(shù)介于4.27%-10.0%。相較于ic-ELISA法，沙丁胺醇TRFIA法的靈敏度提高了3.8倍。
　　對(duì)多效唑的ic-ELISA檢測(cè)體系進(jìn)行條件優(yōu)化，確定其最優(yōu)條件：甲醇含量為10%，Na+強(qiáng)度為0.2 mol/L，pH為7.5。在最佳條件下該方法的IC50為21.35μg/L，LOD為0.43μg/L，線性范圍是1.86-310.9μg/L。抗體對(duì)多效唑結(jié)構(gòu)類似物均沒有明顯的交叉反應(yīng)，表

6、明多效唑抗體的特異性很高。在土壤和河水樣品中的平均回收率介于89.39%-109.25%，變異系數(shù)介于4.24%-7.32%。優(yōu)化多效唑TRFIA檢測(cè)體系的條件，其最優(yōu)條件為：包被原為1.0 mg/L，多克隆抗體稀釋80000倍，Eu3+-二抗稀釋2000倍，甲醇含量為10%，Na+強(qiáng)度為0.2 mol/L，pH為7.5。最佳條件下該方法的IC50為1.09μg/L，LOD為0.012μg/L，線性范圍是0.067-23.05μg/L。