金黃色葡萄球菌對利奈唑胺耐藥機制及其分子基礎研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人體常見致病菌之一，可引起多種嚴重感染，由于耐藥金黃色葡萄球菌的廣泛流行給臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。利奈唑胺作為第一個應用于臨床的噁唑烷類抗陽性菌藥物，被用于各種耐藥金黃色葡萄球菌感染治療，但隨著臨床廣泛應用，細菌對利奈唑胺的快速耐藥引起臨床廣泛關注。本論文對來自全國縣級醫(yī)院門診分離金黃色葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥機制及其分子基礎進行了全面研究，以期對耐藥控制和臨床用藥提供依據。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：收集了

2、2010年至2011年全國12個省30家縣級醫(yī)院分離的475株金黃色葡萄球菌，用稀釋法測定這些菌株對青霉素G、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧及四環(huán)素等藥物的MIC值。根據對利奈唑胺MIC水平的不同，將這些菌株進行分組，分別在各組隨機抽取一定數量菌株進行耐藥機制研究。應用PCR測序法對其中36株菌株篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn

3、1-rrn6)突變點和利奈唑胺靶位L蛋白(L3，L4，L22)基因突變。對475株金黃色葡萄球菌篩檢cfr基因，對efr陽性菌株檢測體外藥敏情況和進行MLST分子分型，并篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突變點和利奈唑胺靶位L蛋白(L3，L4，L22)基因突變。體外藥敏試驗結果顯示，475株菌株對萬古霉素和替考拉寧均敏感，98.7％的菌株對磷霉素敏感，菌株對苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶

4、大霉素、環(huán)丙沙星的敏感率分別為84.7％，85.9％，87.2％，86.6％，73.2％，78.2％，而對青霉素G，克林霉素，紅霉素的敏感率僅為16.4％，48.7％，32.8％。按照CLSI臨床折點，沒檢出對利奈唑胺耐藥菌株。根據細菌對利奈唑胺的敏感性，將這些菌株分為5組:MIC為0.25、0.5、1、2和4μg/ml組。分別從各組選取1株，4株，10株，10株，11株，共36株菌來作進一步研究。經PCR和序列比對分析，共有12株菌在

5、23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)分別發(fā)生T2238C，G2398A，C2263T，C2112T，C2129T，C2219T，G2127A，C2234T，G2416A共9種核苷酸突變類型。有8株菌在分別在L3，L4或L22蛋白發(fā)生8個氨基酸突變。對475株金黃色葡萄球菌篩檢出14株cfr陽性菌株，這些菌株利對奈唑胺的MIC為2μg/ml或4μg/ml，對替考拉寧和萬古霉素均敏感，對氯霉素、克林霉素和紅霉素表現(xiàn)較高的耐藥性。經PCR

6、和序列比對分析，這14株cfr陽性菌株中有3株在23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)發(fā)生核苷酸突變，5株在L3和L4蛋白發(fā)生氨基酸突變。對這些突變點分析發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺MIC為0.5μg/ml時，菌株在23S rRNAdomainⅤ和L蛋白均無發(fā)生突變;MIC為1μg/ml的10株菌中有4株菌在23S rRNAdomainⅤ發(fā)生核苷酸突變，無L蛋白氨基酸突變;MIC為2μg/ml的16株菌中，6株攜帶有cfr基因，有6株菌在23S r

7、RNA domainⅤ發(fā)生核苷酸突變，4株菌在L蛋白發(fā)生氨基酸突變;MIC升至4μg/ml的11株菌中有8株發(fā)現(xiàn)攜帶有cfr基因，3株在23S rRNA domainⅤ發(fā)生核苷酸突變，5株菌在L蛋白氨基酸發(fā)生突變。比較不同MIC組中的突變點和cfr基因發(fā)現(xiàn)，隨著對利奈唑胺MIC值的增高，細菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點數量和類型均增多，這種逐漸遞增的突變點數量和突變類型可能為菌株由對利奈唑胺敏感變?yōu)榕R床耐藥提供條件。
　　

8、第二部分：應用Southem雜交確定cfr的基因定位，用PCR walking技術分析cfr基因的周圍基因序列。同時對第一部分篩選出的9個位于細菌23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)的點突變，應用RNA二級結構預測軟件Mfold和RNA三級空間結構預測軟件3dRNA分別構建23S rRNA domainⅤ區(qū)的二級結構和三級結構，以Pymol軟件對這些空間結構進行突變堿基與藥物空間作用的改變分析。Southern雜交證實在14株菌株中

9、cfr基因位于質粒。對攜帶cfr基因的約5.6kb質粒片段進行測序，結果顯示cfr基因上游是一個IS256插入序列，下游緊鄰的是一個orf1基因然后是一個IS256插入序列。經序列比對分析，發(fā)現(xiàn)本研究的質粒片段與1株來自中國動物源科氏葡萄球菌中攜帶cfr基因的質粒pSS-01在序列上有99％同源性。另外，2個分離自人源的科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的質粒pRM01和p7LC，也與本研究中攜帶cfr基因的質粒片段在序列上有高度相似性。14株

10、cfr陽性菌株中有5株為ST188型，3株為ST965型，而近年來這些型別主要見于中國不同地區(qū)分離的動物源金黃色葡萄球菌。這些結果提示這14株金黃色葡萄球菌或者其攜帶的cfr基因可能來源于動物。對位于23S rRNA domainⅤ區(qū)的9個突變點，分別構建其二級結構和三級空間結構，對結果分析發(fā)現(xiàn):(1) MIC為1μg/ml組中菌株沒有發(fā)現(xiàn)cfr基因或L蛋白突變，僅有的T2238C和G2398A突變點在三級結構上距離利奈唑胺結合位點距離

11、為94.91(A)和102.8(A)，可能是導致菌株對利奈唑胺MIC值輕微增高的原因。(2)MIC為2μg/ml組的位于23S rRNA domainⅤ區(qū)的5個突變點中，突變點C2112T和C2129T在二級結構中的堿基配對均由非常穩(wěn)定的G∶C配對變?yōu)椴环€(wěn)定的G∶U配對，這種二級結構的改變可能使得rRNA莖區(qū)結構變松散或進一步影響三級空間結構;突變點G2127A發(fā)生后，二級結構中的堿基配對由不穩(wěn)定的G∶U配對變?yōu)橄鄬Ψ€(wěn)定的A∶U配對，也

12、會使得二級結構的rRNA莖區(qū)結構穩(wěn)定性發(fā)生變化。并且本組的5個突變點C2112T，G2127A，C2129T，C2219T，C2263T在空間結構上距離利奈唑胺結合位點距離分別為56.06(A)，51.96(A)，54.07(A)，58.83(A)，52.02(A)，距離相對較近，故這5個突變點在這些菌株中對利奈唑胺MIC增高具有較大貢獻價值。且這組菌株在L3或L22蛋白的氨基酸突變在空間上均位于核糖體肽酰轉移酶活性中心（peptidy

13、l transferase center，PTC）區(qū)外，對利奈唑胺MIC值影響較小。(3) MIC為4μg/ml組細菌的突變點C2234T和G2416A在三級空間結構距離利奈唑胺結合位點距離分別為92.16(A)和72.68(A)，距離較遠。本組的11株菌株中有8株攜帶有cfr基因，而本組中的L3或L4蛋白氨基酸突變位于PTC區(qū)外，因此cfr基因可能是本組菌株對利奈唑胺MIC值升高的主因。
　　本研究表明：⑴臨床分離菌株中，沒有檢

14、出符合CLSI耐藥折點的菌株，但細菌MIC值分布范圍廣，最高MIC值菌株和最低MIC值相差16倍，需要嚴密觀察敏感性降低的發(fā)展趨勢，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。⑵隨著利奈唑胺MIC值的增高，細菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點數量和類型均增多，這種逐漸遞增的突變點數量和突變類型可能為菌株由對利奈唑胺敏感變?yōu)槟退幪峁l件。⑶23S rRNA domainⅤ區(qū)突變是MIC為2μg/ml組中菌株對利奈唑胺MIC增高的主因;而MIC為4μg/ml組