針對tlr4基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)對raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用

1、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院。9 S 1 2 0 暑碩士研究生畢業(yè)論文M 螂T E R G R A D U A T l 0 N T H E S I S H U S T針對T L R 4 基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)對R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用I n h i b i t i o n o f R A W 2 6 4 ．6 M a c r o p h a g eI n f l a m m a t o r y R e s p o n s

2、 e b ys m a l l h a p a r i n R N A i T a r g e t i n gT L R 4研究生姓名： 徐建波導(dǎo)師姓名：吳河水學(xué)科專業(yè)：外科學(xué)普外科指導(dǎo)小組成員： 至盤盔莖握單位： 垃壘匡墮迭』塹E 盤王琳副教授單位：協(xié)和醫(yī)院兒 科叢塑近到i l 筮單位：鹽壘垂墮墮豎鹽贊盤墊益耋豎單位：鹽壘匡匿壘蕉! E 盤華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院研究生部華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 碩士學(xué)位論文p E G F P —H 1

3、／s i R N A 為基礎(chǔ)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)工具設(shè)計(jì)針對T L R 4m R N A 的寡核苷酸片段，克隆入p E G F P —H 1 ／s i R N A ，構(gòu)建表達(dá)E G F P 及T L R 4 一s h R N A 的真核表達(dá)質(zhì)粒p E G F P —H 1 ／T L R 4 ，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將p E G F P —H 1 ／T L R 4 轉(zhuǎn)染至小鼠巨噬細(xì)胞系R A W 2 6 4 ．7 ，轉(zhuǎn)染2 4 小時(shí)后予新霉素( G 4

4、 1 8 ) 篩選獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以熒光相差顯微鏡觀察細(xì)胞系中熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，再運(yùn)用L P S 刺激轉(zhuǎn)染的R A W 2 6 4 ．7細(xì)胞，采用熒光定量P C R 檢測其T L R 2 m R N A 的表達(dá)，W e s t e r nb l o t 檢測下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子N F —K B 的表達(dá)，并以E L I S A 法檢測細(xì)胞系分泌炎癥因子的水平變化。結(jié)果 質(zhì)粒p E G F P - H I ／s i R N A 及p E

5、G F P —H 1 ／T L R 4 分別用B b sI 和M l uI 酶切電泳后，前者出現(xiàn)4 ．9 k b 和3 4 0 b p 的的條帶，后者出現(xiàn)5 ．O k b 和2 2 0 b p 的條帶，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)粒長度一致，且測序證實(shí)克隆序列正確。運(yùn)用脂質(zhì)體L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 將p E G F P —H 1 ／T L R 4 轉(zhuǎn)染至R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)型熒光蛋白

6、的表達(dá)率約為( 4 5 ．2 5 ±9 ．2 3 ) ％。獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞，運(yùn)用L P S 對其刺激后，其T L R 2 m R N A 的的表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，N F —K B p 6 5 表達(dá)下調(diào)，且伴有T N F—n 水平的分泌下降。結(jié)論 針對T L R 4m R N A 的s h R N A 可能通過R N A i 機(jī)制對L P S 誘導(dǎo)的R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞炎癥因子