irf5慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細(xì)胞j774a.1穩(wěn)定沉默細(xì)胞系的建立

1、 I暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文 IRF5 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細(xì)胞 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細(xì)胞 J774A.1 穩(wěn)定沉默細(xì)胞系的建立 穩(wěn)定沉默細(xì)胞系的建立Construction of Lentiviral Interference Vector of IRF5 and Establishment of Macrophages J774A.1 Cells with IRF5 Gene Silence 作者姓名：麥莉 指導(dǎo)教師姓名 及學(xué)位

2、、職稱：韋建瑞 碩士 主任醫(yī)師 學(xué)科、專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué) 心血管病學(xué) 論文提交日期：2016-04-10 論文答辯日期：2016-06-01 答辯委員會(huì)主席： 論文評(píng)閱人： 學(xué)位授予單位和日期：暨南大學(xué) 2016-07 暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文 IRF5 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細(xì)胞 J774A.1 穩(wěn)定沉默細(xì)胞系的建立 I中文摘要 中文摘要 目 的 構(gòu)建 IRF5 慢病毒干擾載體以及建立 IRF5 基因沉默巨噬細(xì)

3、胞 J774A.1 穩(wěn)定細(xì)胞系 方 法 1．構(gòu)建攜帶IRF5 shRNA的慢病毒干擾質(zhì)粒載體，進(jìn)行病毒包裝后轉(zhuǎn)染J774A.1 巨噬細(xì)胞， 建立穩(wěn)定IRF5 基因沉默的J774A.1/IRF5 -巨噬細(xì)胞系。 首先利用Oligo Designer3.0 化學(xué)合成方法得到 4 種IRF5 shRNA（IRF5-MUS-649、IRF5-MUS-1059、IRF5-MUS-1322、IRF5-MUS-1578），分別將 4 種IRF5

4、shDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后與目的載體進(jìn)行酶切， 酶切純化后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。 對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定以及測(cè)序， 以證實(shí)目的基因已經(jīng)定向連接目的載體，比對(duì)準(zhǔn)確的即為構(gòu)建成功的目的基因慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體。 大量質(zhì)粒抽提后利用293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，檢測(cè)并標(biāo)定各病毒液滴度。 2．使用 LV3-NC （陰性對(duì)照） 、LV3-649、 LV3-1059、 LV3-1322、 LV3-1578病毒原液分別對(duì)正常 J774A.1 巨噬

5、細(xì)胞株進(jìn)行侵襲測(cè)試， 通過(guò)熒光表達(dá)計(jì)數(shù)挑選最佳的病毒侵襲濃度；用上述 4 種病毒液分別對(duì) J774A.1 細(xì)胞浸染，對(duì)浸染后各組細(xì)胞進(jìn)行分組， 并設(shè)立空白對(duì)照組， 從浸染細(xì)胞中提取 RNA 及蛋白， 用 RT-PCR和 Western-Blot 方法進(jìn)行檢測(cè)， 明確實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 IRF5 表達(dá)水平是否有明顯下降；另外，測(cè)試 Puromycin 對(duì)正常 J774A.1 巨噬細(xì)胞最小致死濃度，以挑選最佳最低的細(xì)胞篩選濃度。 結(jié) 果 1．通過(guò)