脫氮基因工程菌PNS的構(gòu)建及其應(yīng)用研究.pdf

1、目的：采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建脫氮基因工程菌PNS，使其高效表達(dá)cd1-亞硝酸鹽還原酶，催化同步硝化反硝化脫氮工藝中最關(guān)鍵的限速步驟，從而加速脫氮進(jìn)程，提高脫氮效率，降低脫氮成本。 方法：本研究所采用的實(shí)驗(yàn)方法如下： 1．根據(jù)GenBank公布的nirS堿基序列和表達(dá)載體pQE-30的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以銅綠假單胞菌PAO1的基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段nirS；之后經(jīng)過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，

2、定向克隆到pQE-30上，化學(xué)轉(zhuǎn)化 DH5α，構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子pQE30-nirS-DH5α； 2．經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，將重組質(zhì)粒pQE30-nirS轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株SG13009，構(gòu)建脫氮基因工程菌PNS，再用SDS-PAGE和His-tag in-gelStain鑒定PNS所表達(dá)的外源性蛋白(cd1-NIR)的分子量和特異性； 3．為了使PNS能夠在實(shí)際的污水環(huán)境中發(fā)揮高效的脫氮功能，又對(duì)其在厭氧和20℃低溫

3、環(huán)境中的表達(dá)情況進(jìn)行了科學(xué)和詳實(shí)的分析，同時(shí)也對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度和最適誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了合理的優(yōu)化。 結(jié)果：本研究通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)所取得的主要結(jié)果如下： 1．應(yīng)用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了編碼cd1-NIR的nirS基因；經(jīng)過(guò)雙酶切和定向克隆，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pQE30-nirS；經(jīng)過(guò)測(cè)序和BLAST顯示，表達(dá)質(zhì)粒pQE-30中的插入序列與GenBank公布的基因序列完全一致。 2．將重組表達(dá)質(zhì)粒pQE

4、30-nirS轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株SG13009，經(jīng)SDS-PAGE的分子量鑒定和His-tag in-gel Stain的特異性鑒定，成功構(gòu)建了脫氮基因工程茵 PNS。 3．在厭氧和低溫的環(huán)境中，重組蛋白 cd1-NIR 均獲得了較高水平的表達(dá)；同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)形式的分析顯示，在厭氧和低溫的環(huán)境中，PNS所表達(dá)的可溶性 cd1-亞硝酸鹽還原酶的百分比均大于其最適的生長(zhǎng)環(huán)境。 結(jié)論：成功構(gòu)建了高效表達(dá)cd1-亞硝酸鹽還原酶