偶氮染料高效降解基因工程菌構(gòu)建與特性研究.pdf

1、偶氮染料的生物降解已得到較為深入的研究，分離得到多種具有偶氮染料脫色活性的微生物，并有數(shù)種偶氮還原酶基因經(jīng)大腸桿菌表達獲得高純度、高效率的偶氮還原酶，但是酶制劑的應(yīng)用受到各種條件的限制，成本較高。因此，考慮提高微生物本身的偶氮染料脫色活性，以便于工程應(yīng)用。本文的目的是構(gòu)建一株具有較高偶氮染料脫色活性的基因工程菌，并考察其對偶氮染料的脫色特性。 該工程菌是以沼澤紅假單胞菌/大腸桿菌穿梭質(zhì)粒為載體，將外源基因(來自球形紅細(xì)菌Rhod

2、obactersphaeroidesAS1.1737的偶氮還原酶基因)導(dǎo)入受體菌(沼澤紅假單胞菌RhodopseudomonaspalustrisAS1.2352)，使受體菌表達外源偶氮還原酶，從而提高該工程菌的偶氮染料脫色能力。為達到以上目標(biāo)，首先，在工程菌構(gòu)建之前，通過考察外源偶氮還原酶基因的供體菌(球形紅細(xì)菌)和受體菌(沼澤紅假單胞菌)的偶氮染料脫色活性，以及受體菌細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的種數(shù)及其復(fù)制等相關(guān)情況，驗證該構(gòu)建途徑的可行性；

3、進而構(gòu)建穿梭質(zhì)粒及工程菌；最后，以原始受體菌為對照，考察工程菌的生長及脫色特性。 對球形紅細(xì)菌RhodobactersphaeroidesAS1.1737的菌體及其胞內(nèi)粗酶的偶氮染料脫色活性進行考察。菌體在光照缺氧條件可將多種偶氮染料脫色，部分染料24小時脫色率可達90％以上。染料不能作為該菌生長的唯一碳源。35-40℃，中性偏堿環(huán)境(pH7-8)具有較高脫色率。超聲破碎菌體，獲得胞內(nèi)粗酶，經(jīng)RedSepharoseCL-6B凝

4、膠純化，粗酶中偶氮還原酶的含量有一定提高。以甲基橙作為模型染料時，50℃、pH8.0為其粗酶酶促反應(yīng)的最佳條件，并且該酶催化的脫色反應(yīng)符合雙底物的乒乓機理。甲基橙、NADH表觀米氏常數(shù)分別為0.45mM和1.25mM。 前期研究發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌RhodopseudomonaspalustrisAS1.2352具有偶氮染料脫色能力，其胞內(nèi)粗酶亦具有偶氮還原酶活性，催化過程符合乒乓機理。而紡織印染助劑中包括多種表面活性劑，對生物

5、具有一定的毒性，因此，考察表面活性劑對該菌脫色能力的影響具有實際意義。實驗發(fā)現(xiàn)，該菌對兩種陰離子表面活性劑(LAS，Sodiumlinearalkylbenzenesulphonate；SDS，Sodiumdodecylsulfate)有較強的耐受能力，并且能夠在好氧條件下將其降解；LAS對菌體生長的抑制作用明顯大于SDS；0.1％SDS存在時染料脫色受到一定的抑制，較高溫度(30℃以上)時，抑制情況隨溫度提高迅速加重。 為考察

6、沼澤紅假單胞菌RhodopseudomonaspalustrisAS1.2352中存在的質(zhì)粒DNA的情況，根據(jù)該菌的特點和常規(guī)提取方法應(yīng)用中遇到的問題，在堿裂解法基礎(chǔ)上，對其野生質(zhì)粒提取方法進行了優(yōu)化，所得質(zhì)粒DNA純度和質(zhì)量均滿足進一步操作的需要。反向PCR技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，鑒定該菌的野生質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)菌株中攜帶四種野生質(zhì)粒，對其中一種質(zhì)粒進行全序列測定，長2306bp，GenBank注冊號DQ318958。經(jīng)Blast檢索，該序列

7、與EscherichiacoliplasmidpEC157Rom-likeproteingene有97.8％的同源性。其中682個堿基與E.coliplasmidp15Afragmentspecifyingtheoriginofreplication有95％同源性?？梢?，該菌株中能夠同時存在多種質(zhì)粒，并且與大腸桿菌質(zhì)粒有很高的同源性，這一特性有利于進一步的分子生物學(xué)操作。 通過PCR方法，將沼澤紅假單胞菌中的其它基因的啟動子，以

8、及RhodopseudomonaspalustrisAS1.2352用來編碼FormⅡRubisCO(cbbM)的結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點和下游終止子，分別引入到目的基因RhodobactersphaeroidesAS1.1737偶氮還原酶基因片斷azr的上下游。然后，將目的基因片段(包括：啟動子、核糖體結(jié)合位點、結(jié)構(gòu)基因azr和終止子)克隆到沼澤紅假單胞菌/大腸桿菌穿梭克隆載體pHSG-MG上。經(jīng)測序鑒定，和定點突變，修改四處錯配

9、中對翻譯有重大影響的兩處，獲得了符合設(shè)計意圖的載體pHSG-AZR。 將pHSG-AZR電擊轉(zhuǎn)化入沼澤紅假單胞菌，經(jīng)PCR檢菌，證實轉(zhuǎn)化成功，即獲得了所設(shè)計的基因工程菌?？疾觳Ρ裙こ叹c原始菌的生長及脫色情況。兩株菌對30-1200mg/L酸性紅B的脫色率都可達90％以上，并且工程菌的脫色速率比原始菌高20％左右。不同初始pH時，工程菌與原始菌的生長趨勢基本一致，中性偏堿較適合生長；pH7-9工程菌的脫色速率比原始菌高20％左