引物合成常見問題

1、引物合成常見問題引物合成常見問題發(fā)表于201051311:33|只看該作者[轉(zhuǎn)帖]引物合成介紹及常見問題引物1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種主要都是由ABIPE公司生產(chǎn)，無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。申能博彩公司采用的合成儀主要機(jī)型為ABI3900高通量合成儀，合成長鏈主要采用Beckman1000M和PE890

2、9DNA合成儀，引物修飾和高OD數(shù)合成采用ABI394等。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5′羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′羥基；第二步，合成DNA的原

3、料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5′羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。

4、再以三氯乙酸脫去它的5′羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察的考核機(jī)制也使得分裝人員沒有必要故意少給用戶OD數(shù)，因?yàn)闊o論OD數(shù)是否達(dá)到定單要求，我們都統(tǒng)計(jì)為工作量，沒有達(dá)到OD數(shù)的，分裝人員將清單及時報到序列錄入部門安排重合就可以了。合成產(chǎn)量的高低是序列錄入部門人員的考核指標(biāo)之一。一般情況下，引物都有留樣。接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題。（2）分裝沒有問題，但

5、引物抽干或收樣過程中，引物干粉可能意外丟失。這種情況很少見。（3）系統(tǒng)誤差，我們認(rèn)為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實(shí)驗(yàn)。（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數(shù)的含義，沒有能夠正確使用分光光度計(jì)，特別是使用微量測定；用戶沒有將OD讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中OD數(shù)。這種情況比較常見。（5）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導(dǎo)致引物干粉部分丟失。例如，驗(yàn)證標(biāo)2OD引物量是否準(zhǔn)確，