引物合成

1、1.引物是如何合成的？引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種主要都是由ABIPE公司生產(chǎn)，無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的，相鄰的核苷酸通過3

2、→5磷酸二酯鍵連接。第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5羥基；第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3端被活化，5羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生

3、反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPCPAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測

4、定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。2.引物純化方式有哪些，如何選擇？引物純化方式有哪些，如何選擇？◆C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機(jī)溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實(shí)際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。◆OPC純化：OPC純化是根據(jù)DNA保護(hù)基（DMTr基）和Cart

5、ridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化?！鬚AGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈OligoDNA(大于50mer)的純化特別有效?！鬑PLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA

6、片段進(jìn)行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。3.引物的引物的OD數(shù)如何定量？數(shù)如何定量？答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測定的：用紫外分光光度計(jì)，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.21.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。4.需要什么級別的引物？需要什

7、么級別的引物？答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。長度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：Tm=4℃(GC)2℃(AT)對于更長的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：Tm=81.516.6xLog10[Na]0.41(%GC)–600size公式中，Size=引物長度。Tm的定義：Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridized

8、toitscomplementarystr.IntheabsenceofdestabilizingagentslikefmaeureaTmwilldependon3majparameters:Thesequence:aGCrichsequencehasahighermeltingtemperature.Thestrconcentration:higholigonucleotideconcentrationsfavhybridfmatio

9、nwhichresultsinahighermeltingtemperature.Thesaltconcentration:highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的引物（含修飾）的分子量是如何確定的？答：非修飾的引物的MolecularWeight在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計(jì)一個引

10、物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù)x堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接?jì)算MW=(NAWA)(NCWC)(NGWG)(NTWT)(NmodWmod)＋（NxWx）(NiWi)16Ns–62.NANGNCNTNi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WAWCWGWWi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合

11、數(shù)，例如GA混合的分子量為（313.21329.21）2=321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量BaseMolecularWeightA313.21C289.18G329.21T304.19I314.2U290.17常規(guī)修飾基團(tuán)分子量5’Biotin405.453’TAMARA623.605’(6FAM)537.463’Dabsyl498.495’HEX744.133’(6FAM)569.465’TET