乙型肝炎病毒X蛋白與著絲粒蛋白A相互作用關(guān)系的研究.pdf

1、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HBx羧基端分別缺失30aa和40aa的突變體，對Huh7細胞的增殖和侵襲具有完全不同的生物學效應(yīng)，為進一步探討HBx突變體導致肝癌細胞生物學改變的分子基礎(chǔ)，我們通過基因表達譜cDNA芯片和雙向凝膠電泳技術(shù)，對兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞(HBx3'-30/Huh7和HBx3'-40/Huh7)中差異表達的基因和蛋白質(zhì)進行篩選，著絲粒蛋白A(centromere protein A，CENP-A)即是其中在基因和蛋白水平上均上調(diào)表達

2、的分子。CENP-A在肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)組織中的蛋白表達水平和mRNA水平均不同程度地高于配對癌旁組織，CENP-A過表達可促進肝癌細胞增殖，CENP-A表達抑制則促進肝癌細胞凋亡。以上結(jié)果提示HBx基因狀況能夠影響CENP-A的表達水平，但HBx如何上調(diào)CENP-A表達的機制尚未闡明。
　　 本研究采用PCR結(jié)合測序、蛋白印跡和免疫組化的方法，檢測了配對HCC組織中HBx基因突變

3、情況及CENP-A蛋白的表達狀況，并對HBx基因突變與CENP-A表達的相關(guān)性進行了分析，驗證了芯片篩選的結(jié)果。經(jīng)對轉(zhuǎn)染有pcDNA3.0空載體、野生型HBx及HBx3'-40缺失突變體的HepG2細胞株總蛋白進行免疫共沉淀檢測，未觀察到HBx與CENP-A具有物理性的直接結(jié)合。提示進一步研究HBx上調(diào)CENP-A表達的機制應(yīng)從基因擴增和轉(zhuǎn)錄激活角度進行探討，這一機制的闡明將為深入研究乙肝病毒相關(guān)性肝細胞癌的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。<

4、br>　　 背景和目的:
　　 原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一，尤其好發(fā)于亞洲和非洲南部，我國為HCC高發(fā)國家。流行病學資料顯示原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的發(fā)生與肝炎病毒(HBV和HCV)感染、黃曲毒素攝入、酗酒、飲水污染以及遺傳因素等有關(guān)，在我國，乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是HCC的主要病因之一。乙型肝炎病

5、毒X基因是HBV復制所必需的基因，是HBV病毒基因組中最小的開放讀碼框，編碼序列位于1374-1838位核苷酸，全長465bp，編碼長度為154個氨基酸的X蛋白(HBx)。HBx蛋白是一種具有反式激活作用的多功能蛋白，其表達產(chǎn)物不直接作用于雙鏈DNA，而是通過和細胞內(nèi)的多種蛋白相互作用來調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。HBx蛋白廣泛參與病毒的復制、宿主細胞的基因調(diào)控和表達、蛋白質(zhì)降解及細胞信號轉(zhuǎn)導等過程，具有生長因子樣作用可直接刺激細胞生長，并可

6、通過影響正常的細胞周期，干擾DNA的修復以及調(diào)節(jié)肝細胞增殖、分化和凋亡，在HBV感染及HCC發(fā)生、發(fā)展中起著重要而復雜的作用。肝癌組織中存在著高頻自發(fā)的HBx基因突變，點突變或缺失突變的HBx蛋白可能發(fā)揮與野生型HBx蛋白不同的功能，羧基端缺失大于14aa的HBx即喪失其反式激活能力。HBx蛋白功能上的差異與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，缺失突變導致HBx反式激活能力下降，喪失了野生型HBx抗增殖和促進細胞凋亡以及抑制細胞轉(zhuǎn)化的作用，但對其進一步的基因調(diào)

7、控仍知之甚少。本室前期用cDNA芯片和蛋白雙向電泳及質(zhì)譜分析篩選，發(fā)現(xiàn)著絲粒蛋白A(centromere protein A，CENP-A)在HBx突變相關(guān)的肝癌細胞中高表達，以上結(jié)果提示CENP-A表達水平的上調(diào)與HBx缺失突變具有密切的關(guān)系，但HBx是如何上調(diào)CENP-A表達的機制尚未闡明。CENP-A是組蛋白H3樣的變異體，參與調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、募集轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活/沉默、有絲分裂/減數(shù)分裂、DNA修復等過程，在影響細胞基

8、因調(diào)控及其生物學行為方面發(fā)揮重要作用。CENP-A在多種腫瘤中高表達，已證實CENP-A的表達異常與染色體不穩(wěn)定性(chromosomal instability,CIN)有關(guān)。因此，對HBX與CENP-A關(guān)系的研究，將有助于從CIN角度揭示HBV導致細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制，并為深入研究乙肝病毒相關(guān)性肝細胞癌的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 一、構(gòu)建含20例配對癌及癌旁組織的組織芯片，采用免疫組織化學法檢測C

9、ENP-A蛋白在組織中的表達水平；
　　 二、采用western blot方法，檢測同批新鮮肝癌及癌旁組織標本中CENP-A蛋白的表達水平；
　　 三、采用PCR結(jié)合測序技術(shù)，檢測同批新鮮肝癌及癌旁組織標本中HBx基因的突變情況，分析CENP-A的異常表達與HBX基因突變的相關(guān)性；
　　 四、采用多重PCR技術(shù)，檢測同批新鮮肝癌及癌旁組織標本中HBV基因型，分析HBV基因型與HBx基因缺失突變的關(guān)系；
　　

10、 五、構(gòu)建含pcDNA3.0空載體、野生型HBx及HBx3'-40缺失突變體的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細胞，G418篩選出穩(wěn)定表達HBx及HBx3'-40蛋白的細胞株。
　　 六、RT-PCR、qRT-PCR和western blot檢測pcDNA3.0/Huh7、HBx/Huh7和HBx3'-40/Huh-7細胞中的CENP-A mRNA及蛋白表達水平，進一步驗證基因芯片的篩選結(jié)果。
　　 七、HBx蛋白與CE

11、NP-A蛋白結(jié)合關(guān)系的檢測：采用HBx/HepG2和HBx3'-40/HepG2細胞中總蛋白進行免疫共沉淀檢測，觀察野生型和羧基端缺失40個氨基酸的HBx蛋白與CENP-A蛋白之間是否存在物理性的直接結(jié)合作用。
　　 八、將pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-CENP-A和pSilCENP-Al質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞，G418篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。采用細胞周期PCR芯片(PAHS-020A)，篩選CENP-A過表達及干擾表

12、達的HepG2細胞中差異表達的細胞周期相關(guān)蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 一、 CENP-A在肝癌組織中的表達陽性率及表達強度均不同程度地高于配對的癌旁組織。癌組織中HBx基因缺失突變的發(fā)生率明顯高于癌旁組織，不論是肝癌組織還是癌旁組織中，HBx基因缺失突變組的CENP-A蛋白陽性表達率都高于無缺失突變組的，HBx缺失突變與CENP-A蛋白過表達相關(guān)，HBx缺失突變不具有基因型特異性規(guī)律。
　　 二、野生型和羧基端缺