乙型肝炎病毒X蛋白與hDaxx相互作用及對HepG2細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：應用酵母雙雜交法檢測乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx）與hDaxx的相互作用，并初步探討其相互作用后對細胞凋亡的影響，為進一步研究HBx在HBV慢性感染致癌機制中的作用提供一定的實驗依據。 方法： (1)構建酵母菌真核表達載體pGADT7-HBx：根據已知的HBV X基因序列，采用Primer Premier5.0軟件設計一對引物，并分別引入EcoR I與 Xho I酶切位點，PCR擴增X基因；用EcoRI和

2、Xho I分別雙酶切PCR產物和質粒pGADT7，分別純化回收酶切產物，T4連接酶連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。對重組質粒進行酶切及測序鑒定。 (2)構建酵母菌真核表達載體pGBKT7-hDaxx：用EcoRI和SalI分別雙酶切質粒pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7，分別純化回收酶切產物，T4連接酶連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選到陽性克隆后，對重組質粒行酶切鑒定。 (3)酵母雙雜交檢測HB

3、x與hDaxx的相互作用：將酵母菌真核表達載體及酵母菌陰性陽性對照質粒分4組轉化酵母菌AH109，A組為pGADT7和pGBKT7、B組為pGADT7-HBx和pGBKT7-hDaxx、C組為pGADT7-T和pGBKT7-Lam、D組為pGADT7-T和pGBKT7-p53，將轉化菌落接種于SD/-Trp-Leu（二缺）固體平板，30℃培養(yǎng)2～4d。將單個菌落接種于SD/-Trp-Leu-His（三缺）和SD/-Trp-Leu-His

4、-Ade（四缺）平板，30℃培養(yǎng)2～4d。裂解酵母菌，提取蛋白，經SDS-PAGE、Western blot檢測hDaxx和HBx在酵母中的表達。 (4)流式細胞術檢測細胞凋亡：將HBV X基因穩(wěn)定轉染入HepG2細胞(即HepG2X)，再瞬時轉染15μg、30μg和 45μg pcDAN3.1-hDaxx，以pcDNA3.1(＋)轉染HepG2X組和HepG2X組分別作為對照。用10mmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU) 處

5、理36h后分別收集各組細胞，經75％的乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對實驗數據進行LSD-t檢驗分析。 結果： (1)PCR擴增HBV X基因片段（465bp），將X基因克隆至pGADT7載體上，經雙酶切及測序分析，所克隆的目的片段與已知的X基因序列及GeneBank上公布的HBV X基因（Pubmed NC_U95551）序列完全一致。 (2)將p

6、GBDU-C1/hDaxx上的hDaxx基因片段亞克隆至pGBKT7載體上，經雙酶切分析，得約2.2kb大小的hDaxx基因片段，與預期值大小一致。 (3)分4組轉化的酵母菌AH109在二缺陷平板上均可長出白色菌落，但僅有B、D兩組菌可以在三缺和四缺平板上生長，選取B組四缺陷平板上單個菌落，提取酵母蛋白， Western blot檢測到hDaxx和HBx在同一株酵母菌株中均有表達。 (4)將X基因穩(wěn)定轉染入HepG2

7、細胞，Western blot檢測到HBx在HepG2X細胞中的表達。經流式細胞術檢測，HepG2細胞用5-FU處理后凋亡率明顯高于未經5-FU處理的細胞組，結果具有顯著性差異（P<0.01）；HepG2X組細胞凋亡率明顯低于空細胞組，結果具有顯著性差異（P<0.01）；而轉染pcDAN3.1-hDaxx后，細胞凋亡率進一步降低，但與轉染入的pcDAN3.1-hDaxx量沒有劑量依賴關系。 結論： (1)成功地構建了p