實(shí)驗(yàn)二液泡系和線粒的活體染色及觀察

1、實(shí)驗(yàn)二,液泡系和線粒體的活體染色及觀察,College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并了解線粒體和液泡系超活染色的基本原理、方法和注意事項(xiàng)；學(xué)習(xí)如何觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系；了解動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；學(xué)習(xí)并掌握線粒體和液泡系的超活染色技術(shù)。了解植物細(xì)胞液泡系的發(fā)育過(guò)程。,二、實(shí)驗(yàn)原理,活體染色是指對(duì)

2、生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無(wú)毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。,根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的

3、動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。,二、實(shí)驗(yàn)原理,活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性燃料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性較小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來(lái)使用。

4、一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹姆斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。,二、實(shí)驗(yàn)原理,線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠B保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。液泡是細(xì)胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物

5、的主要場(chǎng)所，有十分重要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液泡染成紅色。在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不著色。如果細(xì)胞死亡，染料會(huì)彌散開(kāi)來(lái)，使核著色。,二、實(shí)驗(yàn)原理,三、實(shí)驗(yàn)用品,（一）器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤(pán)、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等。,（二）試劑,1、Ringer 溶液 氯化鈉0.85g（變溫動(dòng)物用0.65g） ；氯化鉀 0.25g ； 氯化鈣 0.03g ；蒸餾水1

6、00ml2、10%、1/3000中性紅溶液 稱取0.5中性紅溶于50ml Ringer溶液，稍加熱（30~40度）使之很快溶解，用濾紙過(guò)濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。 臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3．1%、1/5000詹姆斯綠B溶液 稱取50mg詹姆斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加 微熱（30~40度）使之溶解，用濾紙

7、過(guò)濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。,（三）材料,人口腔上皮細(xì)胞洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞黃豆幼根根尖,四、實(shí)驗(yàn)步驟,（一）線粒體的超活染色與觀察1、線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量雖不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。1）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察 ⑴取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴

8、鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。,⑵實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰部粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將第一次刮下的粘液狀物洗去，將第二次刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。⑶在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢?jiàn)扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀

9、或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。,四、實(shí)驗(yàn)步驟,,口腔頰部上皮細(xì)胞示線粒體,2）植物細(xì)胞線粒體的活體染色與觀察（洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞）,⑴用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴在干凈的載波片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色10～15min。⑵吸去染液，加一滴Ringer 液，注意使洋蔥內(nèi)表皮展平，蓋上蓋片，顯微鏡觀察。⑶在高倍鏡下，可見(jiàn)表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，在其周圍有線粒體被染成藍(lán)綠

10、色，呈顆粒狀或線條狀。仔細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)、數(shù)目和分布。,二、液泡系的超活染色與觀察,中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系（即高爾基體）的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。,小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察,⑴　實(shí)驗(yàn)前，把黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根生長(zhǎng)到1以上備用。 ⑵　用雙面刀片把黃豆幼苗根尖（約1～2cm長(zhǎng)）小心切一縱切面，放

11、入載玻片上的1/3000中性紅染液滴中，染色5～10min。⑶　吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。⑷　在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察，在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，

12、將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。,黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察,五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果,1.在人口腔粘膜上皮細(xì)胞制片中，可見(jiàn)扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。2. 在洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞制片中，可見(jiàn)表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，在其周圍有線粒體被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。3. 在蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞制片中，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核及核仁清楚易見(jiàn)，在細(xì)胞核的上方胞

13、質(zhì)中，有許多被染成玫瑰紅色大小不一的泡狀體。,（示線粒體）2009年攝于新大生科院數(shù)碼互動(dòng)顯微鏡室,4. 在黃豆根尖細(xì)胞制片中，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察，在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。,五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果,黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染

14、色觀察,小麥根尖液泡系（1）,小麥根尖液泡系（2）,六．實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng),1、詹姆斯綠B溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充 分氧化能力。2、實(shí)驗(yàn)中速度要快，以免組織細(xì)胞死亡。,細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求1、在仔細(xì)觀察的基礎(chǔ)上，選擇典型結(jié)構(gòu)進(jìn)行描繪，要求真實(shí)、準(zhǔn)確（注意各部分結(jié)構(gòu)的比例關(guān)系）。2、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點(diǎn)的疏密來(lái)表示，點(diǎn)要圓而一致，不得涂暗影或進(jìn)行其它美術(shù)加工。3、各部結(jié)構(gòu)名稱要在圖的一側(cè)引直線注