基因操作原理

1、第三章 分子克隆載體,,,Molecular cloning vectors,將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞（host cell）的工具稱為載體,載體應具備以下特點：1．在宿主細胞內(nèi)必須能夠自主復制（具備復制原點）,2．必須具備合適的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制,3．有一定的選擇標記，用于篩選,其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備,利用重組DNA技術(shù)分離目的基因，稱之為基因克隆,克隆動詞：指從單一祖先產(chǎn)生同一的D

2、NA分子群體或細胞群體的過程,名詞：指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體。,載體的類型：質(zhì)粒plasmid 噬菌體phage 粘粒載體cosmid 噬菌粒phagemid,由大量的含有基因DNA（即某一生物的全部DNA順序）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫引自《分子生物學》，閻龍飛、張玉麟主編， 北京農(nóng)業(yè)大學出版社，1993,一 、質(zhì)粒的基本特性

3、,第一節(jié) 質(zhì)粒載體Plasmid vectors,1．概念① 染色體外的遺傳因子，能進行自我復制 （但依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)）② 大多數(shù)為雙鏈，閉環(huán)DNA分子，少數(shù)為線性③ 大小1kb～200kb,也有更大,質(zhì)粒的表型: 抗生素的抗性、產(chǎn)生抗生素、降解復雜有機化合物 產(chǎn)生毒素（如大腸桿菌素，腸毒素），限制酶與修飾酶、固氮、殺蟲等,復制子有不同的組成方式（滾環(huán)、?、以及G+/G-）在Ecoli中，使用的大多數(shù)載體都帶有

4、一個來源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復制子其復制方式如下：,,,,,,,RNAII,,ori,,-550,,,,600,400,Rop,RNAI,,RNase H,2．質(zhì)粒的復制① 復制起始區(qū): 通常一個質(zhì)粒含有一個與相應的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復制起始區(qū),合成RNAII即前引物，形成雜交體RNaseH 切割RNAII 使之成熟，形成三葉草結(jié)構(gòu)RNAI 可控制RNAII形成二級結(jié)構(gòu)Rop增強RNAI的作用,② 拷貝數(shù)

5、嚴謹型：拷貝數(shù)有限，大約1～幾個構(gòu)馳型：拷貝數(shù)轉(zhuǎn)多，幾十至幾百,削弱RNAI和RNAII之間相互作用的突變，將含增加帶有pMB1或(ColE1)復制子的拷貝數(shù)，(突變位置位于rop基因或編碼RNAI和RNAII的復制起點內(nèi)),,RNAI的起點上游1個核苷酸G變成了A，從而使得其轉(zhuǎn)錄起點改為下游3個核苷酸處(由于RNAI 5’單鏈的完整對于RNA/RNAII間的相互作用至關(guān)重要因此，pUC質(zhì)?？截悢?shù)的增加看來很可能是由于)縮短的R

6、NAI與RNAII的結(jié)合效率降低所致,pMB1質(zhì)粒的復制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的產(chǎn)物, 因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進行，復制依然能夠我行我素,當存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有pMB1(或ColE1)復制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復制，最后每個細胞中

7、可積聚2-3千個質(zhì)粒。,3．質(zhì)粒的不相容性 兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性在第二個質(zhì)粒導入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復制系統(tǒng)，質(zhì)粒分配到子細胞時會發(fā)生競爭，隨機挑選，微小差異，最終放大。不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子ColE1/pMB1現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個不相容群，ColE1/pMB1 pSC101, p15A,4．轉(zhuǎn)移性

8、在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)要素：移動基因mob，轉(zhuǎn)移基因tra，轉(zhuǎn)移起始位點如：F’質(zhì)粒pBR322有起始位點bom的nic位點，可在第三個質(zhì)粒（如ColK）編碼的轉(zhuǎn)移蛋白作用下，通過接合性質(zhì)粒來進行轉(zhuǎn)移。但大多數(shù)載體無nic/bom位點（pUC）,1. 選擇標記用于鑒別目標DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的宿主挑選出來,二 、標記基因,(1) 氨芐青霉素抗性基因AmpR ampr a

9、mpicillin青霉素抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合, 抑制轉(zhuǎn)肽反應并抑制其活性AmpR編碼一個酶，可分泌進入細菌的周質(zhì)區(qū)，并催化?-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性,青霉素是一類化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA中有一個孢和的噻噬環(huán)（A）和一個?-內(nèi)酰胺環(huán)，6-APA由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽,(2) 四環(huán)素抗性基因 tetr

10、 tetracycline與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位tetr基因編碼一個由399aa組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。,(3) 氯霉素抗性基因 chloramphenicol, Cmr or CatCm與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成目前使用的Cmr來源于轉(zhuǎn)導性P1噬菌體(也攜帶 Tn9)cat基因編碼一個四聚體細胞質(zhì)蛋白(每個亞基23kDa)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，在乙酰輔

11、酶A存在的條件下，催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的形成，該產(chǎn)物不能與核糖體結(jié)合,該酶的表達對分解代射的產(chǎn)物敏感，若細菌利用除葡萄糖以外的碳源生長時，其表達量可增加到原來的5-10倍，在cAMP/ 分解代射的產(chǎn)物基因激活蛋白存在下，依賴于DNA的RNA聚合酶在體外與cat基因啟動子結(jié)合的能力明顯增強。,(4) 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanamycin/neomycin可與核糖體成分相結(jié)合并抑制

12、蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉胺氮基糖苷這兩種抗生素可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH(3’)-II）所滅活，該酶為25kDa，似乎位于外周質(zhì)腔，這些抗生素的磷酸化干擾了它們向細胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)移。,(5) Sup F 琥珀突變抑制基因終止密碼：UAA(赭石), UAG(琥珀), UGA(乳白), supF編碼細菌的抑制性tRNA在某一宿主中含具琥珀突變的tetr 和ampr，只有當含supF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入

13、后，宿主才會對Amp和tet具抗性，supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨 如 ? AN13 , 0.895kb,(6) 其它 正向選擇標記質(zhì)?？杀磉_一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活,2. 篩選標記,(1) ?-互補----- ? complementation LacZ’基因的互補,?-galactosidase 1024aa,,,,,LacZ,LacZ△M

14、15,LacZ’,,,140個aa,編碼缺失第11-41位氨基酸,140個aa + MCS,,,,,IPTG:異丙基-?-D-硫代半乳糖苷 誘導物X- gal: 5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷 底物 (生色劑),?-半乳糖苷酶分解x-gal 形成藍色產(chǎn)物,,MCS : Multiple cloning sites,,LacZ△M15,LacZ’,IPTG/x-gal,LacZ△

15、M15LacZ’,,藍色,LacZ△M15LacZ’? DNA,IPTG/x-gal,,白色,在載體中加入一個短區(qū)段，含LacZ基因的調(diào)控區(qū)和頭140個aa的編碼信息，在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞閱讀框架，相當于在?-半乳糖苷酶的氨基端插入了幾個氨基酸，而不影響未加幾個氨基酸時的功能。lacz?M15 編碼缺失第11-41位氨基酸的?-半乳糖苷酶，但無酶學活性。,當lacZ’與lacz?M15的產(chǎn)生混合在一起時卻

16、有酶學活性，所以在載體上加lacZ/(MSC)，并在受體菌中引入lacz?M15即可實現(xiàn)?-互補。,在生色底物（x-gal）存在下形成蘭色菌落，而外源基因插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致產(chǎn)生無?-互補能力的氨基端片段。,?-互補lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的?-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補,,,LacZ△M15 放在F質(zhì)粒上, 隨宿主傳代LacZ’

17、 放在載體上, 作為篩選標記,(2) 插入失活,相應的受體菌 TG1, XL1-Blue , JM101等,? (lac-proAB)F’[proAB+ lacIq lacZ ?M15],lacI: LacZ阻抑物的編碼基因（lacIq突變使阻抑物產(chǎn)量增加）,三、質(zhì)粒載體的種類① pBR322之前pSC101,ColE1等, 大且酶切位點少轉(zhuǎn)化效率與大小成反比 >15kb 轉(zhuǎn)化效率成為限制因素質(zhì)粒越大

18、，越難于用限制酶切因素進行鑒定質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)就越低,② pBR322以后，調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)，提高載體的效率 pBR322 pUC質(zhì)粒去掉多余片段，提供多克隆位點，篩選標記③ 增加輔助功能/表達載體，穿梭載體,1．克隆載體用于擴增or 保存DNA片段，最簡單的載體① pBR3224361bp， 許多質(zhì)粒載體由此發(fā)展而來，GenBank V01119, J01749 (4361bp)含有30多個單一位點，且

19、Ampr和tetr可通過插入失活進行篩選,,Ap,,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

20、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

21、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

22、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

24、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

25、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

26、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,② pUC18/192686bp 18: L08752 19:X02514來自pBR32

27、2其中LacZ’(MSC)來自M13mp18/19 MSC (10個位點), ?-互補cloning: expression: 利用lacZ promotersequencing: Universal and Reserve primer 引物位置/引物序列,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Multiple cloning sites,ForwardUniversal primer,Reverse primer,

28、,,③ pUC118/119 118: UO7649 3162bp // 119: UO7650 3162bp 帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進入噬菌體顆粒所必需的順式序列，當含這些質(zhì)粒的細胞被適當?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA的其中一條鏈，并包裝子代噬菌體顆粒用途:分離ssDNA 測序，誘變，探針,噬菌粒,④ 體外轉(zhuǎn)錄 pGEM-3Z/4Z 3Z：X65304 4Z：X65

29、305 2.74kb,⑤ 綜合性載體pTZ18/19/U/R pTZ18U L37352(2860bp) 1994pTZ18R L08956 (2871bp) 1993pTZ19R Y14835 (2862bp) 2019 L08957 (2870bp) 1994pTZ19U Y14836(2862bp) 2019 L37382 (2863bp) 1994pGEM-3Zf 3197bppGE

30、M-3Zf(-) X65307 pGEM-3Zf(+)X65306,Bluescript M13 (2958bp)SK(-) X52324 / SK(+) X52325KS(-) X52326 / KS(+) X52331(2961bp)II SK(+) X52328 / II SK(-) X52330II KS(+) X52327 / II KS(-) X52329,e.g p

31、Bluescript II KS(+),載體應具備以下特點：1．在宿主細胞內(nèi)必須能夠自主復制（具備復制原點）2．必須具備合適的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制3．有一定的選擇標記，用于篩選4．其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備,,,,附加因素: MSC, LacZ’(?-互補), ssDNA phage origin, Promoters,2. 表達載體p35s-

32、GFP(U 28417, 4518bp)等,第二節(jié) ? phage vectors,1.最早使用的克隆載體 并對其遺傳學和生理學作了深入研究2.為利用該載體必須熟知其分子生物學，了解載體的設計和組建的原則,一、?噬菌體的分子生物學48502 bp GenBank J02459 or M172335’strand overhangs the 3’ strand by 12 basesGGGCG

33、GCGACCT,,,,? / HindIII(7 個切點)23.1 (kb) 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 564 (bp) 125,? 48502bp,,（一）?發(fā)育調(diào)節(jié)1. 吸附 37℃正常，室溫無噬斑2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期,裂解溶原,?噬菌體生活史簡圖,,,,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,? DNA,Phage particle,lys

34、is,DNA replication,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Integration/excision,reconbination,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Controlregion,

35、Integration/excision,reconbination,Late control,2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期N：正調(diào)節(jié)子使PL和RR繼續(xù)轉(zhuǎn)錄(中和σ-因子的活性)Cro：抑制PL和PR，使積累的Q蛋白引導晚期轉(zhuǎn)錄cII：引導cI表達（PE）cIII：引導int表達（PI）cI：全面抑制并阻斷表達 ( 與QR和OL結(jié)合),Cro/cII的優(yōu)勢，引入不同途徑 宿主/?基因產(chǎn)物的錯綜復雜的平衡正常情

36、況下：Cro/cII各自起作用的機會大致相當，并受外部條件的影響,在延遲早期結(jié)束時，下一步生長所需的蛋白才會表達出來，不可逆地朝裂解循環(huán)或溶原循環(huán)方向發(fā)展,Wild type E. coli ，向溶原和裂解的轉(zhuǎn)變由感染復數(shù)(multiplicity of infection) 細胞的營養(yǎng)狀態(tài)決定的感染復數(shù)越高，營養(yǎng)狀態(tài)越差溶原化(lysogenization)的頻率就越高,溶原現(xiàn)象的生化媒介可能是 3’-5’cAMP

37、,細胞內(nèi)的濃度會隨營養(yǎng)條件的變化而改變當細胞富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長是，cAMP的濃度較低，有利于裂解生長在缺乏cAMP的突變細胞中，更有利于裂解生長由于不知道哪個噬菌體的啟動子受cAMP的調(diào)節(jié)，因此溶原和裂解的選擇部分受到細菌基因或調(diào)節(jié)cAMP的基因,3．進入裂解周期通過?復制，大約合成50個噬菌體基因組單體，然后進入滾環(huán)復制。通過復制，產(chǎn)生基因組DNA的多聯(lián)體(concatemer)，最后被切割并被包裝到噬菌體顆粒中

38、recB/recC/ recD 產(chǎn)物, 外切核酸酶V 抑制DNA ?復制向滾環(huán)復制轉(zhuǎn)變gam可與外切核酸酶V結(jié)合,使之失活,Nul 和 A 蛋白與cosL/cosR結(jié)合在FI蛋白下DNA被纏入前頭中A基因產(chǎn)物的ter功能在cos R/cos L切割 S, R, Rz基因產(chǎn)物, 為裂解必須,Sam7該突變可防止或延遲裂解,?噬菌體的包裝,4．溶原化 只有cI, 及rexA rexB rexC表達

39、cI：236aa cI，cII，cIII發(fā)生突變不能溶原化cIts857：對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變45℃失活誘導因素：如DNA損傷劑（UV）則RecA降解cI,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,,,正常,切離,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,,不正常切離,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導噬菌體的形成,,?d,,,,,?dgal,（二）?的可取代區(qū)1. 區(qū)域溶源化?的正確切

40、離→正常?不正確切離→不正常? gal替換 or bio替換J基因與Cro基因之間的丟失 不影響裂解生長（約1/3）,2. 大小60%區(qū)域為必須 20kb (A→J ) 8-10kb 78～105% 包裝范圍37.831～50.927 可插入9-23kb,二、?噬菌體的選擇標記1. 大小2. LacZ基因 在填充

41、片段中帶有?-半乳糖苷酶基因片段3. cI失活見?gt10,4．Spi篩選Spi+：? 不能感染 E.coli(P2)Spi-：?(red- gam-)能感染E.coli (P2) 形成小噬斑 host recA+ chi位點,· ? 包裝時若gam-，需recA產(chǎn)物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑),所以對宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/

42、gam+可在recA-受體菌中增殖。Charon 32-35, 40·red- gam-時，若外源插入片段含chi位點(8bp),則形成清亮噬斑，否則形成小噬斑，由于chi位點的未知性，因此重組體可形成大小不等的噬斑為避免此問題則在載體中加入chi位點,如?2019, ?DASH, ?F1X,EMBL系列,三、代表性?噬菌體載體插入型載體 insertion vectors置換型載體 replacement

43、vectors,?噬菌體載體主要用于構(gòu)建基因文庫，特別是cDNA文庫。,（一）插入型載體1．?gt10載體 43340bp 插入大小 設計為6kb，理論7.6kbatt及其左側(cè)缺失(b527)，以及N基因至 cII基因之間的突變只在相當于 cI基因內(nèi)有一個 EcoRI位點。用于克隆小的(～6kb)cDNA而設計，外源DNA量有限時較好，克隆效率高,宿主菌：C600(BNN93)增殖載體 supE hsdR(rk

44、-) C600 hflA (BNN102)篩選重組體cI- 在hflA(高頻溶源化)中形成噬斑cI+ 在hflA中形成溶源，產(chǎn)生混濁噬斑， cI+ 的生長受到宿主的抑制50～100倍,2．?gt11 插入型 插入大?。?～7.2kb 在最左側(cè)替代區(qū)置換一段lac5基因，其編碼區(qū)終止密碼子之前有一個EcoRI位點（53bp上游）篩選：在lac

45、-宿主菌中，非重組噬菌斑為蘭色(IPTG) 用途：構(gòu)建cDNA文庫，基因組文庫，表達融合蛋白表達：表達融合蛋白，外源DNA片段有可能與lacZ的閱讀框相吻合，可用免疫學方法篩選,Sam100: supF突變,防止細菌裂解cI：溫敏突變 用來控制噬菌體的復制和融合蛋白的表達,宿主：Y1090(hsdR) lon蛋白酶陰性 supF lac-, 可用于抗體或核酸探針篩選 增殖

46、載體， supF抑制Sam100 Y1089(hsdR) 具有高頻溶源特性 lon蛋白酶陰性， 表達外源蛋白,3. ?GEM-2/4?GEM-2: 43.80kb (0～7.1kb)?GEM-4: 46.2kb (0～4.7kb)同?gt10 ,在cI位點有差異,由EcoRI改位多克隆位點,,,,,,,SpeI XbaI SacI

47、 EcoRI SpeI,,,SP6 T7,,,,,,,SpeI XbaI SacI EcoRI SpeI,,,SP6 AmpR T7,,pGEM-1,4: ?ZAP II

48、與?gt11 相似, 插入pBluescript M13 質(zhì)粒41kb, 0-10kb,Infected by helper phageI--T region will be packaged as a filamentous phagepBluescript plasmids are recovered by infecting an F' strain (AmpR),單個?噬菌體或擴增的文庫與絲狀常助噬菌體共感染E.c

49、oli在細胞內(nèi)，幫助噬菌體中的蛋白(基因II蛋白)識別f1噬菌體正鏈合成起始(I)和終止(T)信號，并在相應位置處切割，在help phage的作用下，切割下來的片段會環(huán)化，被包裝、分泌至細胞外；再感染F菌株，在AmpR下可獲得相應重組質(zhì)粒。Help phage：M13， ExAssist help phage,5. ?Excell 45.5kb,在E.coli NP66中于attL和attR之間發(fā)生同源重組，產(chǎn)生質(zhì)粒

50、pExCell (4190bp)外源DNA插入的大小 6kb 用于cDNA克隆,,,,,,cos,cos,,,AttL AttR,pExCell,? ExCell 載體釋放出質(zhì)粒的原理圖,了解?ZAP11和?ExCell目的在于了解有關(guān)的構(gòu)建原理進一步領(lǐng)會如何利用生物的基本特征來構(gòu)建載體，即對生物的或DNA的某一特征加以利用，為以后的工作提供一種思維方法,（二）置換型載體,,,,

51、,,,cos,cos,R,L,Central stuffer,雜合片段: 含?DNA和其它DNA外源，來自E.coli 或動物,Vector L arm stuffer R arm insertCharon 4A 19.5kb EcoRI/14.7kb 11kb 7～20kb lac5 XbaI/作插入型

52、 0～6kb,,,,,,,,,,E X E E,lac5,Vector L arm stuffer R arm insertCharon32 19.5kb EcoRI/12.5kb 11.9 8-19kb 小鼠DNA內(nèi)有4個 EcoRI位點

53、 20kb HindIII置換 13.3 5～18kb 27kb SacI插入 16.8kb 0～10kb,,,,,,,,,,,,,,,E E E E E E,H3 Sac H3,EMBL 3/4,L 20kb R 9kb 9-23kb Spi篩選 prom

54、ega 19.9kb 8.8kb 7-20kb Mol Cloning,,,,,,,,SalI BamHI EcoRI,EcoRI BamHI SalI,14kb,Charon 40 stuffer containing 235bp repeats 約80copy (lac操縱基因+腺病毒DNA) 內(nèi)含XmaIII/XmaIII/NaeI 左右各16個

55、位點(MCS)用于切開stuffer insert: 9.2～24.2kb,,,,,,,,,,,MCS,MCS,(XmaIII/XmaIII/NaeI)80,?DASH,9-22kb chi+利于染色體步查,,,,,,,,Xba Sal E B H Sac Xho Xba,,,,,,,,,,T3,T7,結(jié)構(gòu)同EMBL 3,?GEM-11 9-23kb chi+ (同EMBL/3/4臂),四、

56、克隆原理及步驟 結(jié)合?包裝過程1．通過裂解過程增殖載體 回收、純化載體2．酶切、載體與外源DNA3．連接4．包裝 5．感染/鋪平板6．篩選,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,包裝感染鋪平板篩選,,陽性克隆,,基因文庫(Lambda),,,9-23kb,Sau3A1,BamHI,連接,N=ln(1-p)/ln(1-f),P: 文庫中出現(xiàn)陽性克隆的期望值F: 插入

57、片段占總DNA的比值,哺乳動物 3x10917kb 99%,N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105,載體與外源片段的連接,去磷酸化回收載體臂部分補平酶切方式（雙酶切，重復片段）,一、粘粒的結(jié)構(gòu)特征1．粘粒實際是質(zhì)粒的衍生物，帶有將DNA包裝到?噬菌體顆粒中所需的DNA序列(cos序列)2．組成：質(zhì)粒復制起點（colE1）,抗性標記ampr cos位點，能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化,

58、增殖3．大?。阂话?kb左右，可克隆38～47kb片段 包括?（38～52kb）,第三節(jié) 粘粒載體 cosmid,N=ln(1-p)/ln(1-f),P: 文庫中出現(xiàn)陽性克隆的期望值F: 插入片段占總DNA的比值,哺乳動物 3x10917kb 99%,N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105,二、克隆原理及步驟1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源

59、DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同3．體外包裝 在?的A蛋白的ter功能作用下切割cos位點并將其中的DNA包裝到成熟的?噬菌體顆粒中去4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細胞并通過cos位點的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復制,三、用途1．在構(gòu)建基因文庫中，減少文庫中重組體的數(shù)目2．在單個重組體中克隆和增殖完整的（較大的）真核基因 雞前?2膠原、鼠三氫葉酸還原酶（DHFR）至少40kb ?載體最大

60、24kb，質(zhì)粒載體雖可攜帶大片段，但轉(zhuǎn)化率低。3．克隆與分析組成某一基因家族的真核DNA區(qū)段如哺乳動物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有數(shù)十萬個bp（幾百kb）,在“步查”過程中，粘粒具有優(yōu)勢，是?文庫的兩倍，粘粒可克隆45kb,染色體步查：chromosome walking采用一段分離自某一重組體一端的非重復DNA片段作為探針以鑒定含有相鄰序列的重組克隆。,,,,,,,,,,,Sau3A1,,,,,,,,,,,

61、,,,,,,,,,,,,,,四、粘?？寺≥d體1．pJB8 簡單粘粒組成: amp ori cos 4個位點5.4kb 可容納33-46.5kb外源DNA片段對載體進行去磷酸化理，否則易形成多聯(lián)載體定向克隆,,,,,,,,,,,,,,,,,,包裝感染鋪平板篩選,,陽性克隆,,基因文庫(E.coli),,33-46kb,Sau3A1,連接,,,,,

62、,,,,,,,,,,,BamHI酶切CIP去磷酸,mcs,COS,2 c2RB6.8kb 含兩個cos位點 ampr kamr ori ColE1 4個E位點35～45kb35～45kb (MobI/經(jīng)CIP處理)一般高濃度ATP存在下（5mmol/L）抑制平端連接，但對粘端沒有影響包裝 感染 篩選,3．pCOS1 EMBL用于篩選體內(nèi)重組的重組粘粒文庫① 構(gòu)建文庫② 在recA-中增

63、殖（體內(nèi)包裝）③ 用?顆粒感染recA+E.coli（pUC18∷探針）④ 發(fā)生重組⑤ 再次包裝⑥ 再次感染，但recA- E.coli(ampr, kamr),,Ori/R6K,Ori/ColE1,Amp probe,,4．卡隆粒9載體系列為克隆33kb以下片段而設計SalI cos MCS amp ori pBR重復單元 SalI9個位點 AvaI (2047bp)n

64、 AvaI在recA-穩(wěn)定,可用于增殖 1-23個串聯(lián)重復pBR322中2kb片段（含tet’）MCS: 9個酶切位點在recA+ E.coli 中可發(fā)生重排用于克隆33kb-2kb，如克隆經(jīng)Southern雜交確定的特定基因組DNA片段.,*：重復單元中含SalI位點，載體中也有一個SalI，當用SalI消化時可將絕大多數(shù)重復片段去掉前提：外源DNA不含SalI,由于SalI識別GTCGAC，但哺乳動物DNA CG序列

65、較少，100kb才能有一個SalI位點,MluI: ACGCGT哺乳動物中平均500kb一次PvuI: CGATCG 300kb一次用于制作限制性酶切圖譜 如 先MluI消化, 再用不切割重復片段的酶部分切割,5．pWE15,五、文庫的擴增和貯存,1. 濾膜影印 25%甘油 TB平板, -70 ?C,2. 混菌保存 混合單菌落, 15%甘油, -7

66、0 ?C,3. 體內(nèi)包裝 重組缺陷?超感染, 重新包裝重組cosmid, 收集裂解混合物, 在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中, 4?C可貯存幾年, 或含7%二甲基亞砜(DMSO) -70 ?C長期保存,生長平衡問題,六、常見問題自我連接、多個外源插入等問題已解決但仍不足以作為常規(guī)克隆，不如?phage,1．基因組DNA質(zhì)量，開始超過200kb2．酶解受到抑制，須梯度離心3．無外源DNA，單個cos → 5%空

67、，雙cos低得多 charomid 高→ 20%4．重組質(zhì)?？截悢?shù)差異大5．盡管文庫似乎全面，但也許不能獲得目的克隆，限制酶位點的非隨機分布，污染限制酶，重組缺失,擴增時目的克隆可能被淘汰。,第四節(jié) 單鏈絲狀噬菌體載體,包括M13 ,f1, fdM13為 6.4kb (6407 base), ssDNA組織形式相同，顆粒大小，形狀相近, DNA同源高，98%差異位于第三密碼子, 互補

68、活躍，彼此間易重組視為等同,一、M13的生物學1．結(jié)構(gòu)6407bp 90% 編碼蛋白11個編碼基因間隔區(qū)小大間隔區(qū)位于VIII/III 和 II/IV，其間有表 達調(diào)控元件,6-7nmx880nm,IG：intergenic region, or IR 非編碼區(qū)，但不是非必需區(qū)，508bp含：對包裝及DNA在病毒顆粒中的定向 進行調(diào)控的順式作用信號，正鏈與負鏈DNA合成起始和終止位點，以