紫外可見分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)、工作原理與應(yīng)用

1、紫外可見分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)原理是：分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團(tuán)吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團(tuán)的信息?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)光譜圖再結(jié)合其它手段進(jìn)行定性分析。根據(jù)LambertBeer定律：A=εbc，（A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)b為液池厚度，c為溶液濃度）可以對(duì)溶液進(jìn)行定量分析。你可以用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定定三種農(nóng)藥的波長(zhǎng)在某溶液中的最大、最小吸收波長(zhǎng)。配

2、制溶液－在光譜檢測(cè)項(xiàng)下進(jìn)行－調(diào)整檢測(cè)光譜范圍及速度－－掃描光譜圖－－吸光度最大處對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)，吸光度最小處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為最小吸收波長(zhǎng)。1.光源燈2.濾光片3.球面反射鏡4.入射狹縫5.保護(hù)玻璃6.平面反射鏡7.準(zhǔn)直鏡8.光柵9.保護(hù)玻璃10.出射狹縫11.聚光鏡12.試樣室13.光門14.光電管.分光光度計(jì)工作原理:由光源燈(1)發(fā)出連續(xù)輻射光線經(jīng)濾光片(2)和球面反射鏡(3)至單色器的入射狹縫(4)聚焦成像光束通過入射狹縫(4

3、)經(jīng)平面反射鏡(6)到準(zhǔn)直鏡(7)產(chǎn)生平行光射至光柵(8)上色散后又以準(zhǔn)直鏡(7)聚焦在出射狹縫(10)上形成一連續(xù)光譜由出射狹縫選擇射出一定波長(zhǎng)的單色光經(jīng)聚光鏡(11)聚光后通過試樣室(12)中的測(cè)試溶液部分吸收后光經(jīng)光門(13)再照射到光電管(14)上.調(diào)整儀器使透光度為100%再移動(dòng)試樣架拉手使同一單色光通過測(cè)試溶液后照射到光電管上.如果被測(cè)樣品有光吸收現(xiàn)象光量減弱放大器處理將光能的變化程度通過數(shù)字顯示器顯示出來.可根據(jù)需要直接在

4、數(shù)字顯示器上讀取透光度(T)吸光度(A)或濃度(C).基本操作:(1)通電儀器自檢預(yù)熱20min(2)用鍵設(shè)置測(cè)試方式:透射比(T)吸光度(A)已知標(biāo)樣濃度方式(C)和已知標(biāo)樣濃度斜率(K)方式光度法.所使用的儀器叫作紫外分光光度計(jì).2.1.2原理因?yàn)樵S多化合物的分子結(jié)構(gòu)中存在共軛雙鍵在200～400nm的紫外光區(qū)具有吸收光的特性所以無需進(jìn)行顯色反應(yīng)便能直接測(cè)定.2.1.3應(yīng)用常用于對(duì)蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行定性定量測(cè)定.蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸

5、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基在波長(zhǎng)280nm處具有最大吸收峰.故常用波長(zhǎng)280nm處的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度.2.1.4特點(diǎn)(1)組成核酸的堿基也含有共軛雙鍵其最大吸收峰的波長(zhǎng)在260nm處.但在280nm處也有一定的光吸收對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有一定的干擾作用.若分別測(cè)定280nm和260nm處的吸光度可通過經(jīng)驗(yàn)公式消除核酸對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響.(2)可對(duì)微量蛋白質(zhì)(1～10gL)不需顯色進(jìn)行直接定量測(cè)定.因此操作簡(jiǎn)便而且可回收樣品.此外

6、鹽類在280nm處無光吸收少量鹽類也不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果.(3)紫外分光光度法完全符合LambertBeer定律的基本原理.在其它條件保持一致的情況下被測(cè)溶液的吸光度與被測(cè)溶液的濃度成正比.2.2UV754型分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和工作原理2.2.1儀器結(jié)構(gòu)由光源由光源(鎢燈或氚燈鎢燈或氚燈))單色器單色器試樣室試樣室接受器接受器(光電管光電管))微電流微電流放大器放大器ACAC轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器打印機(jī)鍵盤和顯示器等部件組成.微處理機(jī)(CPU)通過輸入

7、輸出口(IO)對(duì)微電流放大器顯示器和打印機(jī)等部件進(jìn)行控制實(shí)現(xiàn)儀器的整體功能.2.2.2工作原理UV754型紫外可見分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)1.氚燈2.鎢燈3.濾光鏡4.聚光鏡5.入射狹縫6.平面7.準(zhǔn)直鏡8.光柵9.出射狹縫10.聚光鏡11.試樣室12.光門13.光電管2.2.2工作原理由光源氚燈或鎢燈(1或2)發(fā)出連續(xù)輻射光線經(jīng)濾光鏡(3)和聚光鏡(4)至單色器入射狹縫(5)處聚焦成像再經(jīng)平面反射鏡(6)反射至準(zhǔn)直鏡(7)產(chǎn)生平行光射至光柵