新型傳感界面構(gòu)建及其在農(nóng)藥分子檢測和生物活性研究中的應(yīng)用.pdf

1、農(nóng)藥在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供保障的同時其殘留物也對環(huán)境和人類健康造成危害，這就對當(dāng)前農(nóng)藥研究提出了兩方面的研究課題：一方面，發(fā)展快速、可靠的農(nóng)藥分析檢測方法保障食品安全和品質(zhì)；另一方面，開發(fā)高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥新品種，從源頭上降低農(nóng)藥殘留帶來的副作用。將靶標(biāo)蛋白與底物結(jié)合的高選擇性和分子識別能力與電化學(xué)檢測的靈敏、快速等特點(diǎn)結(jié)合，成為研究高效、便捷的農(nóng)藥分析檢測新方法的發(fā)展趨勢。利用靶標(biāo)蛋白與底物的分子識別能力建立抑制劑離體生物活性分析方法

2、，同樣對實(shí)現(xiàn)新型農(nóng)藥候選化合物的初期篩選和先導(dǎo)結(jié)構(gòu)化合物驗(yàn)證具有重要意義。無論是農(nóng)殘檢測還是藥物篩選，界面構(gòu)建和生物大分子的固定是影響傳感分析信號靈敏度和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。本文利用電化學(xué)和表面等離子體共振技術(shù)，以乙酰膽堿酯酶（ACHE）和D1蛋白酶（CtpA）為靶標(biāo)蛋白構(gòu)建了幾種生物兼容的界面，圍繞發(fā)展基于靶標(biāo)蛋白分子識別的農(nóng)藥分子檢測和生物活性研究新方法這一中心，開展了以下幾個方面的工作： 1.多壁碳納米管-殼聚糖-乙酰膽堿

3、酯酶復(fù)合界面的構(gòu)建及其與底物的分子識別利用戊二醛作為交聯(lián)劑將AChE固定在殼聚糖與多壁碳納米管組成的復(fù)合界面上。殼聚糖作為載體固定酶，為AChE提供一個理想的微觀環(huán)境以保持酶的活性，碳納米管的引入能有效降低酶催化產(chǎn)物硫代膽堿在電極上的氧化電位。固載的AChE能快速靈敏的催化溶液中的底物氯化乙酰硫代膽堿（ATC1），定量檢測ATC1在2.0-20.0μM和20.0-400.0μM兩個濃度區(qū)間內(nèi)與電流響應(yīng)有良好線性關(guān)系，AChE的表觀米氏常

4、數(shù)為132μM。該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、穩(wěn)定可靠，有望為酶抑制劑的檢測提供一個經(jīng)濟(jì)、便利的檢測方法。 2.構(gòu)建多壁碳納米管-交聯(lián)殼聚糖-乙酰膽堿酯酶復(fù)合界面用于殺蟲劑檢測及生物活性分析以多壁碳納米管交聯(lián)殼聚糖復(fù)合膜固定AChE，采用競爭結(jié)合方法，分析溶液中的殺蟲劑與ATC1競爭結(jié)合表面固定的酶。電化學(xué)信號的降低與殺蟲劑三唑磷的濃度在0.03-7.8μM和7.8-32.0μM濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性，并定性分析比較了西

5、維因、馬拉硫磷、樂果對AChE的抑制效果，建立了基于AChE抑制的農(nóng)藥藥效快速分析電化學(xué)方法。改變表面同載的靶標(biāo)酶蛋白，可用于其它酶底物或模擬底物水解產(chǎn)物具有電化學(xué)活性的酶抑制劑的活性比較。 3.銀納米粒子-生物素復(fù)合界面固定乙酰膽堿酯酶檢測有機(jī)磷農(nóng)藥 將自主合成的biotin-聚醚鏈-硫辛酸與11-巰基-1-十一醇混合組裝于金電極表面，以avidin作為橋接將biotin衍生化的乙酰膽堿酯酶（AChE）固定于表面，

6、銀納米通過與avidin之間的靜電引力結(jié)合，進(jìn)而形成銀納米粒子-avidin-AChE復(fù)合界面。以ATC1為底物，根據(jù)氧化峰電流的減少，檢測到樂果在0.05.10.0μM濃度范圍內(nèi)與酶抑制率呈線性關(guān)系，線性擬合的相關(guān)系數(shù)分別0.9983，檢測限為0.01μM。 4.金納米粒子標(biāo)記的氨基甲酸酯與乙酰膽堿酯酶相互作用的表面等離子體共振研究 AChE通過共價鍵固定在11-巰基-1-十一酸的自組裝膜上，將本課題組設(shè)計合成的

7、兩種抑制劑先導(dǎo)化合物（HY1和HY2）通過硫金鍵固定于金納米粒子表面實(shí)現(xiàn)標(biāo)記（記作ALC1和ALC2）。AChE與抑制劑之間的相互作用會引起表面等離子體（SPR）信號的變化，金納米特殊的光學(xué)性質(zhì)放大SPR檢測信號，提高檢測靈敏度，得到AChE與HY1、HY2的結(jié)合動力學(xué)數(shù)據(jù)：結(jié)合速率常數(shù)（Ka）分別為1.46×105（Ms）-1和7.73×104（Ms）-1，解離速率常數(shù)（Kd）分別為4.66×10-2s-1和1.21×10-1s-1，

8、計算得到親合常數(shù)（KA）分別為3.13×106和6.39×105M-1。此體系結(jié)合競爭模式可以實(shí)現(xiàn)其它小分子農(nóng)藥類似物的免標(biāo)記活性比較分析。 5.芯片表面原位形成金納米粒子放大表面等離子體共振信號檢測酶抑制劑 固定反應(yīng)時間，SPR信號與AChE的活性有對應(yīng)關(guān)系，根據(jù)酶活性的抑制程度建立了有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷的高靈敏檢測方法，在0.5-14.0μM濃度范圍內(nèi)，三唑磷濃度與SPR信號呈線性關(guān)系，檢測限為0.05μM。在這個體

9、系中，無論是酶、底物還是分析物都無需標(biāo)記和固定，反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，為農(nóng)藥檢測提供了一種簡單、無標(biāo)記、實(shí)時、靈敏的檢測方法。 6.D1蛋白酶與二茂鐵標(biāo)記24肽相互作用的電化學(xué)檢測及抑制劑活性分析 利用一步沉積法將氯金酸還原成金納米原位沉積于電極表面構(gòu)成金納米-殼聚糖的復(fù)合界面固定CtpA。二茂鐵（Fc）標(biāo)記的24肽作為底物，通過與界面固定的CtpA相互作用結(jié)合到電極表面。結(jié)果表明，溶液中的Fc-24P在2.0-65.0

10、μM的濃度范圍內(nèi)與電流響應(yīng)呈現(xiàn)良好線性，通過測量小分子抑制劑與Fc-24P對D1蛋白酶的競爭反應(yīng)，對三種CtpA抑制劑先導(dǎo)化合物HY1、HY2和NA1進(jìn)行了生物活性分析。 7.D1蛋白酶與金納米粒子標(biāo)記24肽相互作用動力學(xué)的表面等離子體共振研究及其應(yīng)用 金片表面修飾生成羧基化葡聚糖界面后將羧基活化，利用酰胺鍵將CtpA固定在芯片上。利用SPR技術(shù)研究金納米標(biāo)記的24肽與表面固定的CtpA相互作用，得到動力學(xué)數(shù)據(jù)Ka=