DNA和石英晶體微天平為基的傳感平臺(tái)的構(gòu)建及其在靶定生物分子和環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、本論文的工作分為三部分，第一部分是關(guān)于針對(duì)河豚體中河蚌毒素快捷方便檢測(cè)方法的研制;第二部分是關(guān)于石英晶體微天平的傳感平臺(tái)的建立以擴(kuò)大儀器應(yīng)用范圍，針對(duì)生物小分子腺苷的檢測(cè)方法的確立和藍(lán)藻爆發(fā)時(shí)對(duì)藻毒素吸附材料表面設(shè)計(jì)提出建議;第三部分是基于納米金的SPR效應(yīng)所產(chǎn)生的顏色變化與具有pH響應(yīng)的多聚腺嘌呤DNA分子進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建具有pH響應(yīng)的可視化傳感器。
　　 傳感器是將對(duì)靶定分子具有特異性識(shí)別作用的識(shí)別元件與一些信號(hào)轉(zhuǎn)換或放大元件

2、相結(jié)合的分析工具。生物傳感器則是對(duì)生物分子具有響應(yīng)的傳感器或者識(shí)別元件自身就是具有生物活性的材料如蛋白質(zhì)（酶、抗原、抗體、）、DNA和生物膜等。近年來(lái)隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)于食品安全和環(huán)境健康的問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注，對(duì)此類問(wèn)題的檢測(cè)手段的研制也是科研一個(gè)比較集中的課題。對(duì)于環(huán)境和食品檢測(cè)，一些大型儀器可以提供很高的精密度但由于其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、需要專人培訓(xùn)操作而使得這些大型儀器在日常生活和生產(chǎn)中的應(yīng)用有很大的限制。因此開(kāi)發(fā)一些操作簡(jiǎn)單容易制

3、備且成本低廉的傳感器可以有效提高公眾在日常生活中對(duì)有毒有害物質(zhì)的提前防護(hù)意識(shí)，同時(shí)由于操作方便不需培訓(xùn)而使大眾更容易接受。在我碩博期間，我只要集中在對(duì)操作簡(jiǎn)單、制備方便的生物傳感器的方法研究以使得任何沒(méi)有專業(yè)知識(shí)背景的群眾都可以操作;同時(shí)還對(duì)石英晶體微天平為基的傳感平臺(tái)的建立進(jìn)行研究。
　　 河蚌毒素是一種具有生物富集作用的天然神經(jīng)毒素。其可以通過(guò)阻礙鈉泵運(yùn)行而使人體內(nèi)鈉鉀失衡導(dǎo)致人體癱瘓甚至死亡。這種毒素在水生物體中無(wú)法發(fā)揮毒

4、副作用主要是由于水生物體中的鈣泵作用更重要。由于這種毒素穩(wěn)定性好因此無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單殺菌消毒或者高溫烹飪?nèi)コ?，且一旦食入中毒則無(wú)解藥可救，因此對(duì)此毒素在未食用前的檢測(cè)有很重大的意義?，F(xiàn)在研發(fā)出的針對(duì)河蚌毒素的檢測(cè)方法有七種，但是這些方法由于受到儀器復(fù)雜、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的道德問(wèn)題、生物提取物難度大、抗體穩(wěn)定性差等的問(wèn)題而不能大規(guī)模生產(chǎn)日常生活應(yīng)用。我們通過(guò)研究此毒素結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)河蚌毒素結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)背靠背的胍基團(tuán)，這種基團(tuán)與DNA結(jié)構(gòu)中的鳥(niǎo)嘌呤很相似

5、，我們懷疑這種結(jié)構(gòu)的相似性會(huì)影響有鳥(niǎo)嘌呤參與的一些結(jié)構(gòu)形成比如G四聯(lián)體的形成。通過(guò)圓二色譜我們發(fā)現(xiàn)河蚌毒素的存在會(huì)顯著延緩-四聯(lián)體的形成且G-四聯(lián)體的量會(huì)減少，同時(shí)加入越多的河蚌毒素會(huì)誘導(dǎo)G-四聯(lián)體的結(jié)構(gòu)形成更少。而這種阻礙G-四聯(lián)體形成的現(xiàn)象在其他類似物如具有線型胍基團(tuán)的精氨酸、鹽酸胍中則沒(méi)有觀察到。除了結(jié)構(gòu)的研究，我們還進(jìn)行的熱力學(xué)方面的研究。利用等溫滴定微量熱儀，我們觀察到DNA分子與河蚌毒素和其他類似物之間的結(jié)合比和結(jié)合常數(shù)，發(fā)

6、現(xiàn)河蚌毒素與DNA分子的結(jié)合相比于其他類似物更強(qiáng)但弱于DNA與鉀離子之間的作用，很好的解釋了河蚌毒素可以阻礙和干擾G-四聯(lián)體的形成但卻不能使所有DNA分子處于單鏈狀態(tài)。通過(guò)比較河蚌毒素及類似物與DNA之間相互作用發(fā)現(xiàn)，河蚌毒素與DNA的結(jié)合常數(shù)是其他兩種類似物的5到10倍，解釋了河蚌毒素可以干擾G-四聯(lián)體的形成而類似物則不具有這種性質(zhì)。利用圓二色譜和等溫滴定微量熱儀得出的結(jié)論，我們認(rèn)為通過(guò)檢測(cè)有毒素存在的DNA體系中G-四聯(lián)體的量可以間

7、接的測(cè)定體系中毒素的含量。我們采用了一個(gè)廣泛應(yīng)用且價(jià)格低廉的染料結(jié)晶紫作為熒光信號(hào)分子，有研究組報(bào)道此染料可以識(shí)別G-四聯(lián)體和單鏈DNA因此可以作為一個(gè)很好的信號(hào)傳導(dǎo)分子。我們發(fā)現(xiàn)此分子在與單鏈DNA結(jié)合時(shí)會(huì)熒光增強(qiáng)，因此當(dāng)有毒素存在而使部分DNA不能形成G-四聯(lián)體時(shí)，結(jié)晶紫可以與DNA結(jié)合熒光增強(qiáng)而達(dá)到對(duì)毒素檢測(cè)的熒光增強(qiáng)效果。
　　 石英晶體微天平是利用石英震動(dòng)時(shí)有固有的震動(dòng)頻率，震動(dòng)頻率會(huì)由于片子表面有吸附或修飾而產(chǎn)生變化

8、，通過(guò)對(duì)片子震動(dòng)時(shí)頻率和耗散的變化可以達(dá)到對(duì)片子表面吸附材料的質(zhì)量和性質(zhì)測(cè)定的目的。因此儀器在使用初期經(jīng)常用于吸附和機(jī)理研究，但用此儀器進(jìn)行檢測(cè)分析研究的則很有限。在本人碩博期間，由于檢測(cè)的分子均為小分子，因此一直在考慮如何將此儀器應(yīng)用于對(duì)小分子的檢測(cè)中。通過(guò)DNA適配體對(duì)于生物小分子腺苷特異性識(shí)別作用和納米金大的質(zhì)量，利用DNA互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)有小分子目標(biāo)物存在時(shí)，由于DNA結(jié)合目標(biāo)物而產(chǎn)生構(gòu)象變化不能再與負(fù)載納米金的配對(duì)鏈相結(jié)合，而沒(méi)有

9、目標(biāo)物時(shí)負(fù)載納米金的配對(duì)鏈可以配對(duì)到芯片表面而產(chǎn)生很大的頻率信號(hào)。通過(guò)這種方法可以有效改善傳統(tǒng)不能檢測(cè)小分子的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題:即當(dāng)小分子存在時(shí)由于小分子分子量小而產(chǎn)生很小的信號(hào)變化。通過(guò)納米金的擴(kuò)增，存在的小分子越少可以負(fù)載上去的納米金就越多，那么信號(hào)就越大，從而使得對(duì)小分子的低限檢測(cè)成為可能，且由于信號(hào)得到很大增強(qiáng)而使信號(hào)識(shí)別和數(shù)據(jù)處理更加方便。同時(shí)利用DNA分子可逆互補(bǔ)配對(duì)我們也達(dá)到了對(duì)芯片表面反復(fù)利用的目的。
　　 夏天時(shí)藍(lán)

10、藻爆發(fā)時(shí)產(chǎn)生的惡臭和水體中的藻毒素的去除是我們關(guān)系的問(wèn)題之一。常用的去除吸附材料是活性炭。我們考慮到現(xiàn)在塑料產(chǎn)生的污染很大，如果可以通過(guò)對(duì)塑料表面進(jìn)行改性，可以同時(shí)達(dá)到對(duì)水體中藻毒素吸附的去除和變廢為寶清潔環(huán)境雙贏的目的。我們以比較常用的樹(shù)脂材料聚苯乙烯作為本體進(jìn)行吸附材料設(shè)計(jì)的研究。由于藻毒素是一種具有等電點(diǎn)的非蛋白質(zhì)毒素，其受環(huán)境pH的影響很大，在不同的pH會(huì)顯現(xiàn)不同的電性。通過(guò)對(duì)聚苯乙烯表面基團(tuán)設(shè)計(jì)，我們合成了聚苯乙烯樹(shù)脂、季銨化

11、聚苯乙烯和磺化聚苯乙烯三種具有不同電性的聚苯乙烯基體。通過(guò)旋涂將三種不同基底涂敷于石英晶體微天平的芯片上，利用儀器進(jìn)行在線檢測(cè)吸附過(guò)程。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在中性水域，季銨化聚苯乙烯有最好的對(duì)于藻毒素的吸附效果，此結(jié)論可以作為以后對(duì)廢棄塑料改性的一個(gè)理論依據(jù)。
　　 除了研制簡(jiǎn)單制各的熒光傳感器，可視化傳感器的研制也是我的一個(gè)研究課題。利用納米金距離不同產(chǎn)生不同顏色的特點(diǎn)，將其與具有pH響應(yīng)性的DNA分子相結(jié)合，達(dá)到了對(duì)特定pH范圍檢測(cè)