免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義修訂版

1、1親們：曾老師發(fā)來的實(shí)驗(yàn)講義，請(qǐng)下載打印，每次課帶相應(yīng)的講義。1.下周一實(shí)驗(yàn)1點(diǎn)開始，切記時(shí)間不要遲到喲。2.作業(yè)：第一次（今天）的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，還有“大吞噬”和“小吞噬“的圖。3.漂亮美女們要把頭發(fā)扎好，為自己的健康著想喲。實(shí)驗(yàn)一小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)【原理】吞噬細(xì)胞具有對(duì)異物(細(xì)菌、綿羊紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞等)吞噬和消化的功能，在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮重要作用。【目的】1.通過對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活動(dòng)的觀察，加深理解細(xì)胞吞噬作用的過

2、程及其意義。2.掌握小鼠腹腔注射給藥和摘眼球放血及脊椎脫臼處死的方法?！静牧稀啃∈?、2％雞RBC（CRBC）、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、彎頭眼科鑷、1mL注射器【方法】10％的硫乙醇酸鈉溶液腹腔注射1ml（誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞大量滲出）（4d）2％CRBC腹腔注射1ml（45min）摘眼球放血，處死小鼠輕揉腹部1min，剪開表皮，暴露腹膜，剪一小口，取腹腔液（用尖吸管）滴于玻片一端推片（自然干燥）瑞氏染色（10min）沖洗，印干，鏡檢

3、【注意事項(xiàng)】⒈腹腔注射時(shí)勿注入皮下；⒉染色時(shí)玻片勿互相碰觸；⒊觀察時(shí)注意玻片正反面。結(jié)果：吞噬百分率＝吞有SRBC的吞噬細(xì)胞100個(gè)吞噬細(xì)胞100％吞噬指數(shù)＝所吞SRBC數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞36.TrisNH4ClTrisNH4Cl（紅細(xì)胞裂解液）：稱取3.735g氯化銨、Tris（三羥甲基氨基甲烷）1.3g加水溶解并稀釋至500ml。0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。無菌器械的準(zhǔn)備：1.200目篩網(wǎng)、研棒、平皿：提前1d高壓滅菌，烘干

4、備用。2.手術(shù)器械：臨用前酒精擦拭或浸泡、酒精燈火焰滅菌。3.冰?。簩⑺楸糜谝话咨珳\盤(或小塑料泡沫盒)內(nèi)，備用。（三）實(shí)驗(yàn)方法：1、脾細(xì)胞制備：（1）小鼠摘眼球放血、脫頸椎處死，75%乙醇濕棉球擦拭腹部，置于鼠板上固定；（2）在小鼠腹部中間部位剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟；（3）在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，另一鑷子分離脾臟下面的結(jié)締組織，取出脾臟。放入盛有5ml無菌PBS液的培養(yǎng)皿中

5、；（4）制備脾細(xì)胞懸液:無菌取脾，將脾臟放置不銹鋼網(wǎng)（200目）上，置于盛有適量無菌PBS的小平皿中，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，制成單細(xì)胞懸液；經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用PBS洗3次，每次離心2000rmin5min。取出10μl，稀釋后在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5106ml。細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法：①稀釋脾細(xì)胞：在96孔血凝板內(nèi)分別加白細(xì)胞計(jì)數(shù)液90μL孔，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加23個(gè)孔；取脾細(xì)胞懸液10μL，依次10倍稀釋。②取最后1孔

6、的細(xì)胞懸液10μL置于白細(xì)胞記數(shù)板槽內(nèi)，待細(xì)胞不再移動(dòng)，100倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。1mm1mm0.1mm=0.1mm3=0.1103ml=104ml細(xì)胞濃度:細(xì)胞數(shù)ml=5個(gè)中格的細(xì)胞數(shù)x5x104（RBC計(jì)數(shù)法）細(xì)胞數(shù)ml=4個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)4x104（WBC計(jì)數(shù)法）WWWW1mm③根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，取適量細(xì)胞以完全1640稀釋為5106mL2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：將5106ml脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，100ul孔，加6個(gè)孔，再