免疫學(xué)檢驗(yàn)中的酶免疫技術(shù)

1、免疫學(xué)檢驗(yàn)中的酶免疫技術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)中的酶免疫技術(shù)20世紀(jì)中期，以放射免疫技術(shù)為代表的標(biāo)記免疫技術(shù)相繼問(wèn)世，它將某種可微量或超微量測(cè)定的物質(zhì)（如放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等）標(biāo)記于抗原（抗體）上制成標(biāo)記物，加入到抗原抗體的反應(yīng)體系中與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，以檢測(cè)標(biāo)記物的有無(wú)及含量間接反映被測(cè)物的存在與多少。這些將標(biāo)記技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其敏感性高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便、易于商品化和自動(dòng)化等特點(diǎn)逐漸替代了凝集

2、、沉淀等經(jīng)典的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，不僅用于抗原、抗體、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等免疫相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等體液中各種微量物質(zhì)的檢查，可以說(shuō)一切具有抗原性或半抗原性的物質(zhì)原則上均可利用現(xiàn)代免疫檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，使免疫學(xué)檢驗(yàn)滲透到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。目前，免疫學(xué)檢驗(yàn)中的標(biāo)記技術(shù)主要包括酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反

3、應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新。一、常用的酶及顯色底物在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)記的酶應(yīng)具有催化活性高、催化專一性強(qiáng)；與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應(yīng)性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物產(chǎn)生的信號(hào)產(chǎn)物易于觀察和檢測(cè)；對(duì)人無(wú)害且價(jià)廉、易得等特點(diǎn)，目前常用的酶及底物見(jiàn)表1。表1常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加終止

4、液前顏色加終止液前顏色加終止液后顏色加終止液后顏色辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶（HRP）RZ3.1堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）橙黃色藍(lán)色黃色棕黃色黃色黃色二、標(biāo)記物的制備在酶免疫技術(shù)中制備標(biāo)記物的抗原應(yīng)純度高、抗原性完整；制備標(biāo)記物的抗體應(yīng)特異性好、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、比活性高、能批量生產(chǎn)和易于分離純化。制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高；避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物

5、各自形成聚合物；標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。標(biāo)記物制備的方法基本屬于兩類：（一）交聯(lián)法交聯(lián)法是以一可同時(shí)與酶和抗體（抗原）結(jié)合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結(jié)合物為：酶戊二醛抗體（抗原）（二）直接法直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物，如過(guò)碘酸鈉法。形成的結(jié)合物為：酶抗體（抗原）。結(jié)合的標(biāo)記物都存

6、在于液相中，故需用分離劑將二者分開(kāi)后才能測(cè)定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性。而固相酶免疫測(cè)定，是通過(guò)載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上，只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除。目前固相酶免疫測(cè)定以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為最常用。一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（一）基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基本原理是將過(guò)量抗體（抗原）包被于載體上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯

7、色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測(cè)物的存在與含量的檢測(cè)技術(shù)。（二）技術(shù)類型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。1各種技術(shù)類型的原理如下：雙抗體夾心法用于檢測(cè)抗原。它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。間接法用于測(cè)定抗體。它的原理是將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體

8、與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原待測(cè)抗體酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。競(jìng)爭(zhēng)法既可用于檢測(cè)抗原又可用于檢測(cè)抗體。它是用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。捕獲法用于測(cè)定IgM類抗體。固相載體上連接的是IgM的二抗，先將標(biāo)本

9、中的IgM類抗體捕獲，防止IgG類抗體對(duì)IgM測(cè)定的干擾，此步驟也是其稱為捕獲法的原因所在，然后再加入特異抗原和酶標(biāo)抗體，形成抗體IgMIgM特異抗原酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測(cè)IgM成正比，也屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。2.各種技術(shù)類型的主要區(qū)別：見(jiàn)表2。表2ELISA常用技術(shù)類型比較類型類型固相載體上固相載體上的包被物的包被物待測(cè)物待測(cè)物酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物顯色程度與待顯色程度與待測(cè)物含量間的測(cè)物含量間的關(guān)系關(guān)系雙抗體夾心法雙抗體夾心法（