微波誘變?nèi)樗岣弋a(chǎn)菌選育及淀粉廢水發(fā)酵制乳酸工藝研究.pdf

1、針對(duì)目前淀粉工業(yè)廢水處理與資源化以及微生物誘變育種技術(shù)中存在的問(wèn)題，基于分子生物學(xué)和微波輻照技術(shù)，本文進(jìn)行了用于淀粉工業(yè)廢水資源化處理的乳酸高產(chǎn)菌微波誘變育種技術(shù)及相關(guān)基礎(chǔ)研究。建立微波誘變選育高產(chǎn)乳酸菌的技術(shù)方法，并設(shè)計(jì)研制了相關(guān)實(shí)驗(yàn)裝置，進(jìn)行乳酸高產(chǎn)菌株的選育；采用生理生化和分子生物學(xué)方法對(duì)突變菌種進(jìn)行表征，深入探討微波誘變?nèi)樗峋倪^(guò)程和機(jī)制，考查微波場(chǎng)中影響高產(chǎn)乳酸菌選育的主要因素及影響規(guī)律，同時(shí)，對(duì)玉米淀粉工業(yè)廢水用于發(fā)酵制備乳

2、酸工藝進(jìn)行了研究，并將活性炭纖維（ACF）作為固定乳酸菌載體引入發(fā)酵體系，建立了ACF的HNO3-Fe(Ⅲ)改性方法，選擇315型陰離子交換樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液中的乳酸進(jìn)行分離提取。
　　本研究采用干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus casei subsp.）X1-12作為原始出發(fā)菌種，自行設(shè)計(jì)一種功率連續(xù)可調(diào)水循環(huán)冷卻式微波輻照育種裝置，用以抵消微波輻照時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)，在低功率微波條件下，對(duì)干酪乳桿菌X1-12進(jìn)行誘變處理

3、，在微波功率400W，輻照時(shí)間3min的誘變條件下，篩選得到一株突變株W4-3-9，L-乳酸產(chǎn)量為115.8g/L，比出發(fā)菌株提高了58.0％，連續(xù)遺傳10代，產(chǎn)酸性狀穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)微波輻照前后乳酸菌細(xì)胞表面形態(tài)和遺傳物質(zhì)DNA形貌的AFM觀察對(duì)比可知，微波輻照前乳酸菌表面有明顯凸起，而輻照后乳酸菌表面光滑，且遺傳物質(zhì)DNA有明顯的開(kāi)環(huán)和斷裂情況。進(jìn)一步對(duì)出發(fā)菌株X1-12和突變株W4-3-9進(jìn)行了AFLP DNA指紋圖譜分析，聚丙烯酰胺

4、凝膠電泳結(jié)果顯示出差異條帶，并對(duì)d21差異帶進(jìn)行測(cè)序，在GenBank中進(jìn)行BLAST序列類似性檢索，得出該差異序列與乳酸脫氫酶序列相似，說(shuō)明微波輻照后乳酸脫氫酶的酶切位點(diǎn)發(fā)生了變化。
　　將選育的高產(chǎn)L-乳酸菌種W4-3-9應(yīng)用于淀粉工業(yè)廢水為原料制備乳酸工藝中，其結(jié)果表明：玉米浸泡廢水與工藝廢水體積配比為3:7、葡萄糖添加量70g/L、初始pH6.8、接種量5%、在溫度37℃下厭氧發(fā)酵72h，L-乳酸產(chǎn)量可達(dá)62.28g/L，

5、并且發(fā)酵過(guò)程對(duì)廢水的COD有45%的去除，NH4+-N去除率75%。
　　對(duì)淀粉廢水中的微生物進(jìn)行平板稀釋法分離，初步鑒定廢水中存在酵母菌、霉菌、葡萄球菌、芽孢桿菌四類主要微生物。研究微波輻照對(duì)淀粉廢水培養(yǎng)基殺菌條件，達(dá)到培養(yǎng)基細(xì)菌總數(shù)為0cfu/mL時(shí)，微波功率為500W，輻照時(shí)間100s。廢水培養(yǎng)基中總糖、還原糖、蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分滅菌后損失率為：11.76%、18.77%和7.42%，優(yōu)于高壓蒸汽滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分損失。
　　

6、實(shí)驗(yàn)選擇315型陰離子交換樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液中的乳酸進(jìn)行分離提取，通過(guò)吸附等溫線實(shí)驗(yàn)及上柱條件與洗脫條件優(yōu)化，最終確定最佳上柱流速為1.5BV/h、上柱pH1.9、洗脫劑為去離子水、洗脫流速為1BV/h。在實(shí)現(xiàn)乳酸與乙酸、檸檬酸、丙酮酸及葡萄糖等良好的分離基礎(chǔ)上，乳酸純度從原發(fā)酵液中的72.4%提高到85.3%，從吸附到洗脫，全過(guò)程中乳酸提取率為79.2%。
　　采用固定化菌體發(fā)酵法，研究ACF載體影響乳酸菌固定化的影響因素。實(shí)驗(yàn)用濃H

7、Cl、H2SO4、HNO3及FeCl3對(duì)ACF表面進(jìn)行改性，并對(duì)改性前后的ACF進(jìn)行XPS射線衍射表征和表面菌膜厚度掃描電鏡觀察，HNO3-Fe(Ⅲ)協(xié)同改性后單絲菌膜厚度為40μm。ACF表面酸性含氧官能團(tuán)增加，表面正電荷也增加，改性后ACF表面特性能很好地促進(jìn)乳酸菌的吸附固定，固定乳酸菌的ACF載體用于發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵時(shí)間縮短到48h，L-乳酸產(chǎn)量68.6g/L較無(wú)載體發(fā)酵的L-乳酸量增加了6.4g/L，同時(shí)為后序乳酸發(fā)酵液分離提供了