微生物的遺傳變異與育種

1、微生物的遺傳變異與育種,第八章,本章內(nèi)容：,基因突變與誘變育種基因重組菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,第一節(jié) 基因突變與誘變育種,一、基因突變：,（一）突變類(lèi)型：,基因突變與誘變育種,細(xì)胞形態(tài)形態(tài)突變型 菌落形態(tài) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型生化突變型 抗性突變 抗原性突變（包括細(xì)胞內(nèi)部、表面成分的　　　　　　　　　　　

2、 改變）致死性突變型（合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變，則表現(xiàn) 出致死突變）條件致死突變型：如突變?yōu)闇囟让舾行停?7℃死， 25℃ 活） 其它突變型：毒力突變、糖發(fā)酵突變、產(chǎn)量、產(chǎn)品突變等,按表型分,,,,溫度敏感型突變,基因突變與誘變育種,（二）突變的特點(diǎn)：,1）

3、不對(duì)應(yīng)性：環(huán)境與變異無(wú)對(duì)應(yīng)性 2）自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)生 3）稀有性：生物體的自發(fā)突變率為10-10～10-12 4）獨(dú)立性：一個(gè)基因的突變對(duì)其它基因突變無(wú) 影響 5）誘變性：誘變劑可提高突變率10~105倍 6）穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳 7）可逆性：有回復(fù)突變,基因突變與誘變育種,（三）基因突變自發(fā)性及不對(duì)應(yīng)的證明：,基因突

4、變與誘變育種,變量彷徨試驗(yàn)： 涂布試驗(yàn)試驗(yàn)： 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)：,自發(fā)突變：沒(méi)有人工誘變因素的參與，生物體的自然突變,1.變量彷徨試驗(yàn)：,1)抗性細(xì)胞的出現(xiàn)，是在接觸噬菌體之前；2)噴上噬菌體，僅起淘汰野生型和鑒別抗性株作用；3)由于甲方高度彷徨，說(shuō)明突變是隨機(jī)的。,基因突變與誘變育種,2. 涂布試驗(yàn),基因突變與誘變育種,1、突變與噬菌體無(wú)關(guān)；2、涂布使抗性菌株均勻分布；3、抗性突變可在任何時(shí)間發(fā)生，與噬菌

5、體存在無(wú)關(guān)。,以上實(shí)驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理間接證明。,3. 平板影印,基因突變與誘變育種,實(shí)驗(yàn)表明：從未接觸 str 的菌株可發(fā)生抗性突變， 分離可得到純的 str r 菌株。,由此表明：,突變是自發(fā)的與環(huán)境不對(duì)應(yīng)的。,基因突變與誘變育種,（四）基因突變的機(jī)制：（自學(xué)） （五）紫外線(xiàn)(U.V)對(duì)DNA的損傷及修復(fù): （自學(xué)）,二、突變與育種,（一）自發(fā)突變與生產(chǎn)育種,基因突變與誘變育種

6、,1.生產(chǎn)選育：群體培養(yǎng)中個(gè)別的變異個(gè)體表現(xiàn)出 生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)突變種后，隨時(shí)分離、純化。2.定向培育：用特定的環(huán)境長(zhǎng)期處理某一微生物 群體,同時(shí)不斷對(duì)其移種、傳代，以達(dá)到積累 和選擇合適的自發(fā)突變 體的一種育種方法.,3、自發(fā)突變的機(jī)制：,自發(fā)突變(spontaneous)：在非人為的情況下由于 遺傳 物質(zhì)的微小變化引起的性狀變異。原因可能是：1

7、）環(huán)境因素；2）自身有毒產(chǎn)物的積累；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；4）環(huán)出效應(yīng)等。,基因突變與誘變育種,（二）誘變育種,1. 概念：誘變育種是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過(guò)篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。,基因突變與誘變育種,2. 誘變劑：,2）種類(lèi)： 物理因子（phisical agents) 化

8、學(xué)因子(chemical agents) 轉(zhuǎn)座子(transposable elements)物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。,基因突變與誘變育種,1） 概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。,化學(xué)誘變劑：,烷化劑 (alkylating agents)： 如：氮芥、硫酸二乙酯、亞硝基胍、NTG等 機(jī)制：將烷烴加在含氮堿基上，改變氫鍵性質(zhì) 堿基類(lèi)似物 (base a

9、nalogs)： 如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）等； 機(jī)制：在DNA復(fù)制時(shí)將堿基類(lèi)似物插入DNA中，而堿 基類(lèi)似物沒(méi)有正常堿基的氫鍵性質(zhì)，在DNA復(fù) 制時(shí)出現(xiàn)突變體。,基因突變與誘變育種,插入劑 (intercalating agents):,,,如：溴化乙啶等一些三環(huán)分子。機(jī)制：與DNA中的一對(duì)堿基有大致相同的位點(diǎn)，這些分子 不改變堿基的氫鍵性質(zhì)，而插入在雙螺旋中，

10、加寬間 距，引起堿基增加。,基因突變與誘變育種,3. 誘變程序：,基因突變與誘變育種,原始菌種,純化,斜面/肉湯培養(yǎng),單孢子/單細(xì)胞懸液,誘變劑處理,平板分離,移至斜面,小試,中試,初篩,復(fù)篩,,,,,,,,,,,計(jì)算存活率,觀(guān)察形態(tài)變異，挑單菌落,良種保藏,原菌種特性鑒定,4. 誘變的主要環(huán)節(jié),1）誘變劑的選擇：,基因突變與誘變育種,a. 了解誘變劑的性質(zhì)、作用機(jī)理和使用方法b. 處理方式： 單一因子處

11、理： 復(fù)合因子處理：兩種以上因素,先后使用同時(shí)使用單一因子重復(fù)使用,,c. 處理劑量：測(cè)致死率。,方法,平板菌落計(jì)數(shù)法紙片法,,一般殺菌率為70%左右。,基因突變與誘變育種,Ames test：對(duì)化學(xué)誘變劑做檢測(cè),菌種：鼠傷寒沙門(mén)氏菌 his -；原理： his -在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)；而發(fā)生回復(fù)突變則長(zhǎng)。,基因突變與誘變育種,Ames test 方法示意圖,用于檢測(cè)食品、飲料、藥物和飲水等

12、樣品的中致癌物,基因突變與誘變育種,2）出發(fā)菌株： 育種的原始菌種；應(yīng)具備：,對(duì)誘變劑的敏感性高；生產(chǎn)中選育過(guò)的自發(fā)變異菌株；本身具有一些有利性狀；對(duì)代謝產(chǎn)物有一定積累；已經(jīng)發(fā)生過(guò)某些變異。,基因突變與誘變育種,3）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備,a. 必要性： 單細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑 避免出現(xiàn)不純的菌落——菌種退化,基因突變與誘變育種,,b. 制備： 物

13、理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl) 化學(xué)誘變劑——緩沖液,c. 方法：,三角瓶?jī)?nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑）用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾。,d. 濃度： 細(xì)菌、放線(xiàn)菌 108個(gè)/ml 霉菌、酵母菌 106個(gè)/ml,基因突變與誘變育種,4)設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法,初篩： 平

14、板上做定性、半定量的測(cè)定，觀(guān)察突變株 的生理效應(yīng)范圍。方法：梯度平板法；（抗性菌株） 紙片法； （抗性菌株） 透明圈法；（淀粉酶產(chǎn)生菌株等） 變色圈法；（氨基酸生產(chǎn)菌株）,基因突變與誘變育種,如：用梯度平板法篩選抗性菌株,基因突變與誘變育種,抗生素法直接篩選抗藥性突變體,基因突變與誘變育種,復(fù)篩：,較精確的生物化學(xué)分析方法 ——做搖瓶測(cè)定（見(jiàn)P250

15、）,基因突變與誘變育種,三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選,（一）概念：,基因突變與誘變育種,1. 三種遺傳型個(gè)體,營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能 力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng) 有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)的變異菌株。 如：lys - ; bio - ;,野生型(wild type)：自然界分離到的任何微生物

16、，在 其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為 該微生物的野生型。如：lys + ; bio + ;,原養(yǎng)型 (prototroph) ：指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組 后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。,2、篩選用的培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基（minimal medium,MM）[-]：滿(mǎn)足野生

17、 型菌株?duì)I養(yǎng)要求最低成分的組合。 完全培養(yǎng)基（complete medium,CM）[+]：滿(mǎn)足一 切auxo生長(zhǎng)的天然或半組合培養(yǎng)基。 補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplemented medium,SM）[x]：在 MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成 分以滿(mǎn)足相應(yīng) auxo生長(zhǎng)的組合培養(yǎng)基。,基因突變與誘變育種,（二）篩選方法,auxo的鑒

18、定,基因突變與誘變育種,誘變處理,auxo的濃縮,auxo的檢出,,,,1. 誘變處理（同前）,auxo的篩選程序：,,,,,,,,,,,基因突變與誘變育種,細(xì)菌培養(yǎng),離心洗滌,誘變處理,CM后培養(yǎng),洗滌,MM加PN,涂布于CM平板,影印培養(yǎng),挑取,鑒定,菌種保存,2. auxo的濃縮：,基因突變與誘變育種,1）抗生素法： 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞，對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無(wú)作用。方法：菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基

19、中。,,2）菌絲過(guò)濾法：,適用于絲狀（放線(xiàn)菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過(guò)濾膜，野生型菌絲不能通過(guò)。,基因突變與誘變育種,3）差別殺菌法：,基本培養(yǎng)基上只有野生型生長(zhǎng)，加熱殺死野生型營(yíng)養(yǎng)體，保留auxo芽孢。細(xì)菌——80℃酵母——60 ℃適用于產(chǎn)芽孢、孢子菌。,基因突變與誘變育種,3. auxo的檢出,1）逐個(gè)檢出法,基因突變與誘變育種,2）影印平板培養(yǎng)法,,3）限量補(bǔ)充法 （在mm中加0.

20、01%蛋白胨， auxo菌落小，野生型菌落大）,基因突變與誘變育種,3）夾層培養(yǎng)法,4. auxo的鑒定,基因突變與誘變育種,1）生長(zhǎng)譜法方法簡(jiǎn)便；回變和污染不影響 結(jié)果測(cè)定物質(zhì)可為粉末 或紙片,混合氨基酸法步驟：,a. 將多種營(yíng)養(yǎng)因子編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12

21、 四組：4 8 11 13 14 五組：5 9 12 14 15,基因突變與誘變育種,2）混合氨基酸（Vit）法,1）每組內(nèi)無(wú)重復(fù)的營(yíng) 養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出 現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng) 分別出現(xiàn)二次,營(yíng)養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意：,基因突變與誘變育種,b. 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)c. 結(jié)果分析,a. 將多種營(yíng)養(yǎng)因子

22、編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12 四組：4 8 11 13 14 五組：5 9 12 14 15,5. auxo 的應(yīng)用,1）作為標(biāo)記菌株：進(jìn)行基因工程、誘變育種、 代謝過(guò)程的研究中的親本標(biāo)記；2）作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；3）作為aa、維

23、生素、堿基的測(cè)定菌株。,基因突變與誘變育種,第二節(jié) 基因重組,本節(jié)內(nèi)容： 原核生物的基因重組 真核生物的基因重組,基因重組：,把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個(gè)體的方式。,基因重組——分子水平的雜交一般雜交——細(xì)胞水平,基因重組,甲生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低,乙生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高,,基因重組,基因重組,如：,生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高,一、原核生物的基因重組,（一）轉(zhuǎn)化（transformat

24、ion),基因重組,受體菌(receptor)直接吸收來(lái)自供體菌(donor)的DNA片段，通過(guò)交換，將其整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個(gè)轉(zhuǎn)化子(transformation)。 這種受體菌接受供體菌的DNA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。,概念：,1. 感受態(tài),基因重組,不同菌株的親緣關(guān)系 受體細(xì)胞是否處于感受態(tài),,感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)

25、 現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。,不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時(shí)間不同。,轉(zhuǎn)化的決定因素：,2. 感受態(tài)因子,一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD,基因重組,其作用為：,催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來(lái)DNA片段吸收可降解細(xì)胞表面某種成分，使DNA受體暴露 1）不同菌細(xì)胞DNA受體位點(diǎn)不同2）有的菌感受態(tài)因子只對(duì)同種菌起作用,3. 轉(zhuǎn)化因子：,轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是供體DNA片段一般為線(xiàn)狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；轉(zhuǎn)化的

26、頻率往往很低，一般為0.1～1%。 據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的 轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高,基因重組,4. 轉(zhuǎn)化的檢出,甲（受體） strr，lys-,基因重組,如出現(xiàn)strr，lys+的菌株，則表明已經(jīng)轉(zhuǎn)化,乙（供體）strs，lys+,在含str的MM上培養(yǎng),,轉(zhuǎn)化的全過(guò)程（以噬菌體為例）,基因重組,（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),以噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合

27、，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,基因重組,概念：,轉(zhuǎn)導(dǎo)以溫和噬菌體為媒介，其從宿主DNA上誘導(dǎo)裂解時(shí)可能有三種情況：,1）包入的完全是噬菌體的DNA（噬菌體）2）包入的完全是細(xì)菌DNA（完全缺陷噬菌體）3）部分帶有噬菌體基因的DNA（部分缺陷噬菌體）,基因重組,1. 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,1）完全轉(zhuǎn)導(dǎo)(complete transd

28、uction)： 由完全缺陷噬菌體將外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)交換、整合、復(fù)制形成遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 此時(shí)受體細(xì)胞的特點(diǎn)：a. 不發(fā)生溶源化； b. 不顯示免疫性； c. 不會(huì)裂解產(chǎn)生正常噬菌體。2）流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction)： 外源DNA片段不經(jīng)交換、整合、復(fù)制，僅轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和 性狀表達(dá)。 特點(diǎn)：子代

29、只有一個(gè)細(xì)胞帶有重組子性狀。,基因重組,由完全缺陷噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,2. 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：,指通過(guò)部分缺陷噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,基因重組,,部分缺陷噬菌體：λ噬菌體帶有宿主gal基因——λdgal噬菌體λ噬菌體帶有宿主bio基因——λdbio噬菌體特點(diǎn)：a、無(wú)正常溶源化能力； b、受體細(xì)胞不具免疫性。,根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的高低，可分為：,1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）：

30、 部分缺陷噬菌體比例低，獲得局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子量極少。,2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）：,雙重溶源菌：感染λdgal噬菌體后，又感染正 常λ噬菌體，且同時(shí)整合在菌染色體上。,HFT裂解物：誘導(dǎo)裂解雙重溶源菌，裂解物 中含等量的兩種噬菌體，稱(chēng)此裂解物為~。,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：用低感染復(fù)數(shù)的HFT裂解物感染 另一gal-受體菌時(shí)，可高頻地將其轉(zhuǎn)化 為gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種方式稱(chēng)~,3.

31、 溶源轉(zhuǎn)換與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別（自學(xué)）,基因重組,（三）接合(conjugation),供體與受體細(xì)胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA的過(guò)程。在受體細(xì)胞中發(fā)生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為接合。通過(guò)接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱(chēng)接合子。,基因重組,概念：,（四）原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）,使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）的過(guò)程。,基因重組,已成功地應(yīng)用

32、與植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、屬間、科間的遠(yuǎn)緣細(xì)胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細(xì)胞基因組。,過(guò)程：,基因重組,二、真核微生物的基因重組,基因重組,（一）有性雜交,一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。,凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動(dòng)、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。,（二）準(zhǔn)性雜交（parasexual hybridization）,同種異株的兩個(gè)體細(xì)胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而導(dǎo)致

33、低頻基因重組發(fā)生的一種繁殖方式。（單倍體體細(xì)胞重組）,基因重組,1. 準(zhǔn)性生殖,2. 準(zhǔn)性生殖的意義：,對(duì)一些沒(méi)有有性過(guò)程但有重要生產(chǎn)價(jià)值的半知菌來(lái)說(shuō)，進(jìn)行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準(zhǔn)性生殖提供了一個(gè)重要的手段。 發(fā)現(xiàn)存在構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線(xiàn)菌中，使之有普遍意義。,3. 過(guò)程,1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;2）形成異核體（heterocaryon）; 細(xì)胞質(zhì)、核交流形成

34、異核菌絲體。3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點(diǎn)：頻率低，10-5～10-7促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫4）體細(xì)胞交換和單倍體化,基因重組,半知菌的準(zhǔn)性生殖示意圖,基因重組,異核體的特點(diǎn)：,1）具有感受性的兩種菌絲間才可形成異核體；2）具有野生型性狀，可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ； （基因互補(bǔ)功能）3）大多數(shù)異核體的分生孢子不能在基本培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)；如能生長(zhǎng)，則為異核體、或?yàn)殡s合 二

35、倍體（重組子）。,基因重組,異核體：同一菌絲有不同遺傳性狀的核在同一 細(xì)胞質(zhì)中生長(zhǎng)。同核體：同一菌絲中只有一種核。,體細(xì)胞交換和單倍體化,雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂的過(guò)程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子、雙倍體及非整倍體。,A,B,A+B,（同核體）,（異核體）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（雜合二倍體）,單倍體雜合子,,,,,,基因

36、重組,4. 檢出：,1）若MM和CM上差別不大的，為穩(wěn)定 的雜合二倍體2）若MM上不長(zhǎng)，CM上大量長(zhǎng)，為不 穩(wěn)定異核體,基因重組,第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,一、菌種的衰退和復(fù)壯,1.衰退： 概念：菌種經(jīng)長(zhǎng)期的人工培養(yǎng)或保藏，在 其自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良 性狀變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象，稱(chēng)為衰退。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,現(xiàn)象：,菌

37、落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生 能力下降；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。,衰退的原因： 有關(guān)基因負(fù)突變,1）多次傳代造成負(fù)突變數(shù)量增加 如斜面保藏： 細(xì)菌：1個(gè)月 酵母菌：3個(gè)月 放線(xiàn)菌、霉菌、芽孢：半年2）培養(yǎng)條件；3）誘變時(shí)出現(xiàn)

38、不純菌落。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2. 防止衰退的方法：,控制傳代次數(shù)； 選擇合適的培養(yǎng)條件； 采用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行傳代； 采用有效的菌種保藏方法。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3. 菌種的復(fù)壯：,復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu) 良性狀的方法。,復(fù)壯的方法：,1）純種分離： 菌落純（劃線(xiàn)法、涂布法、傾注法） 菌株純（單細(xì)胞挑取法）2）通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯；3）淘汰已衰退

39、的個(gè)體。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,二、菌種保藏：,1. 目的：,存活，不丟失，不污染防止優(yōu)良性狀喪失隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種,2. 原理：,創(chuàng)造一定條件，盡可能降低微生物代謝活動(dòng)強(qiáng)度，使之基本上處于休眠狀態(tài)。,條件：1）挑選優(yōu)良純種的休眠體；2）創(chuàng)造適合長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件（干燥、低溫、 缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑等）,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3. 方法：,1）暫時(shí)保藏法——斜面保藏,

40、方法：斜面置4℃冰箱保藏，定時(shí)傳代原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降優(yōu)點(diǎn)：適用于各種微生物、簡(jiǎn)便易行、易 于觀(guān)察；缺點(diǎn)：保藏時(shí)間短、傳代頻、易退化、易 污染、工作量大。,改良方法：橡皮塞取代棉塞、加礦油,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2）長(zhǎng)期保藏法,方法： 砂土管法 真空冷凍干燥法 液氮法,原理：運(yùn)用干燥、低溫和隔絕空氣

41、等手段，降低 微生物菌種的新陳代謝速率，使菌種的生 命活動(dòng)處于半永久性的休眠狀態(tài)，以達(dá)到 長(zhǎng)期保存的目的。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,1）砂土管法：,干法：（適用于部分真菌、放線(xiàn)菌）將斜面上 孢子刮下，接種于無(wú)菌砂土管中（砂 裝試管2/5)，攪拌均勻。濕法：斜面中加3~5ml無(wú)菌水制成菌懸液，取菌

42、 懸液10滴加入砂土管，以管內(nèi)砂全部濕 潤(rùn)為宜。,將砂土管置于干燥器中真空干燥，低溫或室溫下保藏 適用于放線(xiàn)菌、芽孢菌和某些真菌保藏。 保藏時(shí)間幾至幾十年。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2）真空冷凍干燥法,原理：加有保護(hù)劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥， 使微生物細(xì)胞處于半永久的休眠狀態(tài)，以達(dá)到長(zhǎng) 久保藏的目的。方法：用無(wú)菌脫脂牛奶作保護(hù)劑

43、，加入3ml于斜面中制成 菌懸液，分裝在安瓿中速凍真空干燥。 真空度維持在0.1~0.3mmHg,懸液維持凍結(jié)狀， 水分不斷升華，至菌體混合物呈疏松狀，熔封。優(yōu)點(diǎn)：適用于各種微生物；便于大量保藏；可避免污染， 菌種存活時(shí)間長(zhǎng)（幾到幾十年）缺點(diǎn)：手續(xù)繁瑣。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3)液氮超低溫保藏法：,方法：用10%甘油、二