生物技術(shù)概論蛋白質(zhì)工程

1、第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering,主講教師 林娜 碩士,主要講授內(nèi)容：1 概述2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)3 蛋白質(zhì)工程的研究方法 4 蛋白質(zhì)工程技術(shù)的應(yīng)用5 蛋白質(zhì)組學(xué),,本章要求：了解蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)理解蛋白質(zhì)的研究方法了解蛋白質(zhì)的運(yùn)用了解蛋白質(zhì)組學(xué),在自然界中，構(gòu)成生命最基礎(chǔ)的物質(zhì)有： 蛋白質(zhì) 最重要 核酸 最根本

2、 多糖 脂類,,,,,各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)有關(guān),1 概述1.1 蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)很重要具體表現(xiàn)在：,1）蛋白質(zhì)執(zhí)行著酶的功能2）通過(guò)激素調(diào)節(jié)代謝作用3）產(chǎn)生相應(yīng)的抗體4）構(gòu)建各種生物膜,1.2 蛋白質(zhì)工程,蛋白質(zhì)工程就是在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程自誕生之日起，就與基因工

3、程密不可分。,2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure) 2.1.1 定義 指氨基酸按一定的順序通過(guò)肽鍵相連而成的多肽鏈，也是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。 2.1.2 Anfinsen原理 每一種蛋白質(zhì)分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級(jí)結(jié)構(gòu)，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結(jié)構(gòu)，也就是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級(jí)三級(jí)等高級(jí)結(jié)構(gòu),2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),2.1.3 等電點(diǎn),蛋白質(zhì)顆粒的

4、電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)游離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子（凈電荷為O)，此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI)。,2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）,2.2.1 定義 二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）2.2.2

5、主要形式 α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等,四種不同的α－螺旋,在平行（A）和反平行（B）β－折疊片中氫鍵的排列,,反向β－折疊,,RNase的一些二級(jí)結(jié)構(gòu),,2.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）,三級(jí)結(jié)構(gòu)主要針對(duì)球狀蛋白質(zhì)是指整條多肽鏈由二級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建成的總?cè)S結(jié)構(gòu),胰島素的三級(jí)結(jié)構(gòu),,2.4 四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternary structure）,四級(jí)結(jié)構(gòu)是指在亞基和亞基之間通過(guò)疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合成為有序

6、排列的特定的空間結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每個(gè)球狀蛋白質(zhì)稱為亞基,血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu),,2.5 蛋白質(zhì)分子間的相互作用,亞基間的聚合可以被解離，可以重新聚合四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子亞基間可以雜交多肽與蛋白質(zhì)分子間可以聚合,2.6 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，HPDB數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)

7、預(yù)測(cè)，如 Homology 等軟件分析,常用蛋白序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù),PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)PIR蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)OWL非冗余蛋白質(zhì)序列EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)TrEMBLEMBL的翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)GenBANK核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)PROSITE蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)SWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示DSSP蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)FSSP已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族SCOP

8、蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫(kù)CATH蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域,2.7蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,2.7.1 結(jié)構(gòu)決定功能必須基團(tuán)、非必須基團(tuán)2.7.2 如何利用結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的功能的呢？正逐步被揭示,3 蛋白質(zhì)工程的研究方法3.1蛋白質(zhì)工程的研究策略,反向生物學(xué)技術(shù)根據(jù)對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來(lái)的數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空

9、間結(jié)構(gòu)。,序列功能預(yù)測(cè)流程圖,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)流程圖,3.2 蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì),3.2.1 設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇3.2.2 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)與方法序列最簡(jiǎn)化法 3.2.3 改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)3.2.3.1 基本步驟3.2.3.2 人工定點(diǎn)突變M13載體法 PCR法,4 蛋白質(zhì)工程技術(shù)的應(yīng)用,4.1 胰蛋白酶4.2 金屬硫蛋白 4.3 人白細(xì)胞介素-24.4 組織纖溶酶原激活因子4.5 枯草桿菌蛋

10、白酶,金屬硫蛋白（Metallothionein) ，簡(jiǎn)稱MT,含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子 MT分子呈橢圓形，分子量為6500道爾頓，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域拼接在一起，每個(gè)分子含7-12個(gè)金屬原子，具有特殊的光吸收，構(gòu)象較堅(jiān)固，具有較強(qiáng)的耐熱性。,4.2 金屬硫蛋白,金屬硫蛋白的六大功能,1)清除體內(nèi)自由基、防止機(jī)體衰老：MT是體內(nèi)清除自由基能力最強(qiáng)的一種，其清除羥自由基的能力約為SOD的10,000倍2)解除重金屬的毒性：MT的巰

11、基基團(tuán)（-SH）能強(qiáng)烈螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳等　　 3)參與體內(nèi)微量元素的代謝：在體內(nèi)，MT可根據(jù)體內(nèi)微量元素的狀況對(duì)鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘的吸收、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和釋放等進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，使機(jī)體達(dá)到最佳生理狀態(tài)。,4.2 金屬硫蛋白,4)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種不良狀態(tài)的適應(yīng)能力：當(dāng)機(jī)體處于各種不良狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)MT含量增加，從而提高鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘等微量元素的濃度，機(jī)體適應(yīng)能力隨之增強(qiáng)。 5)鋅元素的

12、貯存庫(kù)：每100毫克鋅金屬硫蛋白含6.9毫克鋅，肝、腎中的鋅元素主要是以金屬硫蛋白的形式貯存。 6)防止細(xì)胞癌變：MT可消除自由基、重金屬（砷、汞、鎘、鉻、鎳）、烷化劑、電離輻射以及紫外線對(duì)DNA、RNA、酶、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的損傷，從而可以防止它們的致癌、致突變作用,4.2 金屬硫蛋白,從1978年到2019年共舉行了四次國(guó)際專題研討會(huì)，我國(guó)將MT列入863重大攻關(guān)計(jì)劃，2019年列入國(guó)家級(jí)[火炬計(jì)劃]。結(jié)果表明：MT在

13、抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、美容護(hù)膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對(duì)人體的危害及抗過(guò)敏等方面均有顯著療效。,結(jié)構(gòu)域的拼接,5 蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics） 2019年的Science雜志已把蛋白質(zhì)組學(xué)列 為六大研究熱點(diǎn)之一，其“熱度”僅次于干細(xì)胞研究,5.1 人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃概述,2019年，國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織宣告成立。一項(xiàng)是由中國(guó)科學(xué)家牽頭執(zhí)行的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃

14、”；另一項(xiàng)是以美國(guó)科學(xué)家牽頭執(zhí)行的“人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃”，由此拉開(kāi)了人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃的帷幕。,5.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的研究意義和背景,隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn)，生命科學(xué)研究已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在這個(gè)時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。 2019年，澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心：Australia  Proteome  Anal

15、ysis  Facility  (  APAF ),5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容包括：,5.3.1 蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。5.3.2 翻譯后修飾：很多mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷 酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式

16、。5.3.3 蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析，基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能分析。另外對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)出來(lái)后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個(gè)很好的工具。5.3.4 分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。,5.4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),

17、5.4.1  蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備 5.4.2  蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離和分析 雙向凝膠電泳－質(zhì)譜技術(shù)、二維色譜  (2D-LC)、二維毛細(xì)管電泳  (2D-CE)、液相色譜－毛細(xì)管電泳  (LC-CE),5.5 蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展趨勢(shì),在基礎(chǔ)研究方面，蛋白質(zhì)組研究技術(shù)被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域 在應(yīng)用研究方面，蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找

18、疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一 在技術(shù)發(fā)展方面，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法將出現(xiàn)多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢(shì)和局限的特點(diǎn),5.6 蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床研究中的應(yīng)用,臨床蛋白質(zhì)組學(xué)是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究，它主要圍繞疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等方面開(kāi)展研究，比如體液蛋白質(zhì)組學(xué)、心血管蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué),從對(duì)基因的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)改造，主要原因如下：,（1）任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即