層析技術(shù)的應(yīng)用

1、合成車間培訓(xùn)教材第1頁共19頁層析技術(shù)的應(yīng)用層析技術(shù)的應(yīng)用一、層析技術(shù)的原理和分類（一）層析技術(shù)的原理層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物

2、質(zhì)上的成分；另一是流一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動相，即可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒。動相，即可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒。當待分離的混合物隨溶媒（流動相）通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨溶媒向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，

3、向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到將各組份分離的目的。（二）層析法分類見表165～7（三）層析法的特點與應(yīng)用表165按兩相所處狀態(tài)分類流動相液體氣體液體液液層析法氣液層析法固定相固體液固層析法氣固層析法層析法是根據(jù)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而建立的分離分析方法。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測出層析

4、后各組份的濃度或質(zhì)量，同時繪出層析圖。層析儀與電子計算機聯(lián)用，可使操作及數(shù)合成車間培訓(xùn)教材第3頁共19頁紙層析法用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離薄膜層析法將適當?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物質(zhì)的分離二、層析法實驗技術(shù)（一）凝膠層析法凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分

5、離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。⒈凝膠的選擇根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。如果實驗?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們在分配系數(shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG25和G50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（10005000）的脫鹽可使用SephadexG10，G15及BioGelp2或4。如果實驗?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進行分離，這種分離又叫分

6、級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。2、柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗，組別分離時，大多采用230cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在15cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴重。長度L與直徑D的比值LD一般宜在710之間，但對移動慢的物質(zhì)宜在3040之間。⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆