反向液相色譜的工作原理

1、誰(shuí)能告訴我一下反向液相色譜的工作原理嗎？它與正向的有什么區(qū)別嗎？高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子

2、型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，

3、現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用

4、非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為

5、2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動(dòng)相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出根據(jù)分離機(jī)理—分配色譜—樣品組分的分配系數(shù)不同—吸附色譜—樣品組分對(duì)固定相表面吸附力不同—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開(kāi)—離子交換色譜—不同離子與固定相商相

6、反電荷間的作用力大小不同根據(jù)極性—流動(dòng)相極性＞固定相極性反相色譜—流動(dòng)相極性＜固定相極性正相色譜氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。所以，HPLC的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)氣相色譜。一、吸附色譜（adsptionchromatography）又叫液固色譜法：流動(dòng)相是液體，固定相是固體。分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附

7、劑是多孔性微粒物質(zhì)表面有吸附中心。樣品組分與流動(dòng)相競(jìng)爭(zhēng)吸附中心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留時(shí)間不同和實(shí)現(xiàn)分離。固定相：固定相通常是強(qiáng)極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。流動(dòng)相：弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷甲醇、乙酸乙酯乙腈等。應(yīng)用：對(duì)于極性，結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離

8、。缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生不對(duì)稱峰和拖尾現(xiàn)象。二、分配色譜原理：固定液機(jī)械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據(jù)他們?cè)诹鲃?dòng)相和固定相間的溶解度不同，分別進(jìn)入兩相分配而實(shí)現(xiàn)分離。固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。根據(jù)極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上涂布的是極性固定液；流動(dòng)相是非極性溶劑；可分立極性較強(qiáng)的水溶性樣品；弱極性組分先洗脫出來(lái)。反相分配色譜—固定相載體上涂布的是非極性或弱極性固定液；流動(dòng)相是極性