分子雜交的概念及基本原理

1、分子雜交1分子雜交的概念及基本原理主要內(nèi)容：一、分子雜交的概念二、分子雜交基本原理（一）DNA變性：1、DNA變性的方法2、增色效應(yīng)3、溶解曲線4、融解溫度5、影響Tm值的因素。（二）復(fù)性：退火一、分子雜交的概念：分子雜交（molecularhybridization）指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針

2、，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。二、分子雜交基本原理：（一）DNA變性：DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。1、DNA變性的方法：1)加熱；2)改變DNA溶液的pH；3)有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。2、增色效應(yīng)：DNA在260nm處有最大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DN

3、A雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時(shí)由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA變性，以溫度對(duì)紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點(diǎn)對(duì)分子雜交3四、核酸探針的標(biāo)記方法五、雜交信

4、號(hào)檢測一、探針的概念：放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）。探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。二、探針的種類極其選擇：基因探針根據(jù)標(biāo)記物不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。1、DNA探針：DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對(duì)以上的

5、雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之GC百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點(diǎn)：①這類探針多

6、克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。2、cDNA探針：cDNA（complementaryDNA）探針是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對(duì)）。cDNA