大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及細胞培養(yǎng)注意事項

1、1.成年大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)?步驟1.獲得海馬細胞?大鼠乙醚麻醉，斷頭處理；?迅速解剖海馬組織，置于含有2ml4℃的HibernateAB27的35mm的培養(yǎng)皿中；?隨后將其移入含有同上培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，去除腦膜及多余的腦白質（？）；?將海馬移入組織切碎機冷處理臺面上事先用HibernateAB27潤濕的濾紙上，沿海馬長軸將組織切成0.5mm的薄片，隨后將其移入含有5ml4℃的HibernateAB27的離心管中；?30℃震蕩8min。?

2、大吸管將其移入含有木瓜蛋白酶（預熱至30℃）的離心管，置于170rpm的旋轉平臺（保持組織片懸浮狀態(tài)），30℃水域溫育30min；?將海馬組織切片移入15ml含有2mlHibernateAB27的離心管中，30℃溫育5min，吸管吹打10次（30s），靜置2min，將上清移入另一離心管，重復上述步驟2次；2.梯度分離?將細胞懸液加入Nycoprepgradient（4ml）的上方，室溫，1900rpm，離心15min；去除最上方的碎片；

3、吸管收集含有細胞的部分；用5mlHibernateA稀釋；第三層富含神經(jīng)元；將第四層用2mlB27:NeurobasalA重懸，1100rpm離心1min；3.蓋玻片處理：50ugmL多聚D賴氨酸（無菌水溶解）包被過夜，吸去多余的多聚賴氨酸，無菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.?細胞接種：以目標密度稀釋于B27:NeurobasalA，以每蓋玻片60到120Ul接種，置于5%CO2:9%O2中孵育1h；?將蓋玻片移入24孔培養(yǎng)板中每孔以0

4、.4ml37℃B27NeurobasalA漂洗一次，去除未貼壁細胞及細胞碎片；改用0.4ml的生長培養(yǎng)基；?培養(yǎng)后4天，每34天更換一半培養(yǎng)基；新的培養(yǎng)基中的FGF2含量是遠培養(yǎng)基的2倍；1.培養(yǎng)器皿的準備：培養(yǎng)器皿的準備：1）溶液瓶——裝配各種溶液——輸液瓶；2）螺口瓶——血清或培養(yǎng)基；3）培養(yǎng)瓶——細胞培養(yǎng)——一般采用帶螺口的，清洗時注意防止蓋子中墊片的丟失；相通維持PH的恒定；取出是應旋緊開口；2）保持培養(yǎng)箱內空氣的潔凈，定期用酒

5、精或紫外線消毒；3）保持培養(yǎng)箱內較高的濕度——定期在外箱內加水或將無菌潮濕的紗布置于托盤內；(三)高壓蒸汽滅菌器——適用于玻璃器皿、塑料器皿、橡膠制品、金屬制品及培養(yǎng)用水、平衡鹽液、布料的消毒滅菌。1）滅菌的液體應置于耐高溫的玻璃器皿中，容量為總容量的12~34，瓶塞要有通氣口；5.培養(yǎng)用液：培養(yǎng)用液：(一)水1）培養(yǎng)用水一般使用三蒸水，或者二蒸水去離子處理；高壓蒸汽滅菌后使用；2）新鮮使用，一般不超過2周；3）外購的蒸餾水一般為金屬蒸

6、餾器制備，一般需要用石英或玻璃蒸餾器在蒸餾一次(二)平衡鹽：1）取材和分離細胞中，細胞必須全程維持于生理PH和滲透壓的平衡鹽液中；2）以酚紅作為指示劑，正常呈紅色，酸性呈黃色，堿性呈紫色；酚紅一般對細胞無毒，但在強光下可產(chǎn)生細胞毒性。3）碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)在空氣中易變堿；磷酸鹽緩沖系統(tǒng)、HEPES可維持空氣中的酸堿平衡。4）配置時：用新鮮培養(yǎng)用水配置；溶質稱量應準確；先溶解CaMg，再溶解其他成分，且前一種物質溶解后再溶解后一種物質；先將

7、物質溶解于少量液體，配置完后再定容；5）用高壓蒸汽滅菌（8磅15min）或過濾除菌6）滅菌后4℃貯存7）配置的平衡鹽的PH并不是細胞最合適的，根據(jù)情況調節(jié)PH至7.2~7.48）Hanks（HBSS）——DHanks（不含CaMg，不含葡萄糖）(三)血清：1）外觀：清亮透明，棕黃色或土黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠2）清蛋白35~45g球蛋白20g血紅蛋白越低越好3）存儲：?新購血清——56℃30min熱滅活（高品質胎牛血清及新生牛血