海綿附生微生物對底棲硅藻附著性能的影響.pdf

1、生物污損在全球范圍內(nèi)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾百億美元，生物污損防治成為世界范圍的難題。傳統(tǒng)防污漆中的毒性化合物由于毒性大、難降解，使用受到越來越嚴(yán)厲的控制，尋找高效的環(huán)境友好的抗污損化合物成為目前迫切需要解決的問題。海綿具有抵御生物污損的化學(xué)防御機(jī)制，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，海綿的抗污損活性物質(zhì)的真正生產(chǎn)者是其附生微生物，因此海綿附生微生物成為尋找抗污損天然產(chǎn)物的良好來源。微型生物污損——生物膜對大型污損生物的附著和后續(xù)生長起關(guān)鍵作用，并最

2、終導(dǎo)致復(fù)雜的污損生物群落的形成，若前期生物膜演替過程被阻止則后續(xù)大型生物，特別是硬殼生物的附著將被阻止，因此對材料表面初期微型生物污損進(jìn)行防控，不僅能夠避免生物膜帶來的危害，而且能夠防止大型污損生物的附著。
　　在光線能照射到的范圍內(nèi)，生物膜的主體是微型植物——硅藻。因此，在生物污損防治中抗硅藻附著是避免后續(xù)大型生物附著的必須和關(guān)鍵的一步，開發(fā)對包括硅藻在內(nèi)的各種污損生物廣譜有效的抗污損材料，是解決生物污損問題的必然途徑。硅藻的殼

3、縫系統(tǒng)和胞外多聚物(EPS)對于生物膜的形成和發(fā)育具有重要作用，都是影響底棲硅藻附著的重要因素。
　　本研究以抗硅藻附著的活性菌株和活性菌株粗提物為工具，以底棲硅藻形成的生物膜和分泌的胞外多聚物為研究對象，研究底棲硅藻在菌株或粗提物干擾下，附著性能受到的影響。用抗硅藻附著生物測試方法，從海綿附生微生物菌庫中篩選出活性菌株;用活性菌株和底棲硅藻進(jìn)行菌藻直接接觸的對峙試驗，確定菌株抗硅藻附著的活性來源;用活性菌株粗提物對硅藻進(jìn)行處理，

4、研究硅藻生物膜的形成情況，以及硅藻胞外多聚物的分泌情況，并對胞外多聚物進(jìn)行分離純化，分析其單糖組成和變化，尋找與硅藻附著性能密切相關(guān)的單糖或單糖組合。研究的結(jié)果如下:
　　1、從美國圣璜島海綿附生微生物菌庫中的224個樣品中篩選出24個具有抗硅藻附著活性的菌株集合。對224個樣品中已經(jīng)完成種屬鑒定的菌株樣品進(jìn)行多樣性分析，它們分屬于4個門類23個屬，85％的菌株集中在厚壁菌門和變形菌門，Bacillus屬的菌株最多。對224個菌株

5、進(jìn)行活化培養(yǎng)和小規(guī)模發(fā)酵，獲取粗提物。在24孔板中進(jìn)行粗提物濃度為100μ/mL的抗硅藻附著急性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海綿附生微生物菌株粗提物對硅藻的附著有明顯的影響，對硅藻的附著表現(xiàn)出中性、抑制和促進(jìn)的效果，粗提物的效果與硅藻的種類相關(guān)。從抗污損活性即抑制硅藻附著的角度出發(fā)，從224個菌株中共篩選出24個活性菌株，粗提物濃度在100μg/mL時，至少能同時抑制四種硅藻附著。從24個活性菌株粗提物中選取5個樣品進(jìn)一步降低濃度，測試粗提物在不同濃

6、度下對兩種硅藻Nitzschia closterium和Amphora sp.的抑制效果的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著粗提物濃度的降低，菌株粗提物抑制硅藻附著的能力也隨之降低。所有粗提物樣品針對Amphora sp.的EC50均高于其針對N.closterium的EC50。也就是說，同一個粗提物樣品對不同硅藻附著的抑制效果差別顯著。推測不同硅藻對粗提物處理的敏感性差異可能與硅藻的殼縫系統(tǒng)密切相關(guān)。為了確定抗硅藻污損天然產(chǎn)物的菌種來源，綜合菌株的

7、形態(tài)特征和基因序列分析，對兩個未知種屬的活性菌株進(jìn)行了菌種鑒定，UST050418-708被鑒定為Psychrobacter arcticus，UST050418-694被鑒定為Microbacterium testaceum。
　　2、本文將活性菌株和附著硅藻共培養(yǎng)，研究菌藻之間的關(guān)系。在24孔板中進(jìn)行4株活性細(xì)菌和硅藻Stauroneis sp.直接對峙實驗，改變菌藻比例，觀測硅藻的附著率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌藻比例高時，各活性菌株抑

8、制硅藻附著的活性明顯增強(qiáng);各菌株在不同菌藻比例條件下，抑制硅藻附著活性最強(qiáng)的部分一般都集中在上清液，而菌體的抑制活性相對較弱，有的甚至有可能刺激硅藻附著，全菌液的活性強(qiáng)弱一般處于上清液和菌體之間。本研究在三角瓶中進(jìn)行活性菌株UST050418-708和硅藻Stauroneis sp.的大體積菌藻對峙試驗，共培養(yǎng)16天后發(fā)現(xiàn)，活菌和全菌液都有一定的促進(jìn)硅藻生長的作用，滅活菌對硅藻生長影響不大，而上清液抑制硅藻的生長。同時，活性菌株也影響硅

9、藻的附著，會改變硅藻細(xì)胞在生物膜和懸浮部分之間的分布，菌株上清液使附著的硅藻比例減少，活菌體和滅活菌體使附著硅藻的比例增大。推測菌體滅活過程使細(xì)菌的細(xì)胞破裂并使胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)或促進(jìn)硅藻附著的物質(zhì)釋放出來，同時抑制硅藻附著的活性成分在滅活菌體的過程中失活分解，導(dǎo)致附著硅藻比例上升。
　　3、本文用活性菌株UST050418-708的粗提物處理兩種硅藻Stauroneis sp.和Amphora sp.，然后進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，研究活性菌株

10、粗提物對兩種硅藻生長、附著的影響，以及對硅藻胞外多聚物EPS的分泌和單糖組成的影響，并比較兩種硅藻的反應(yīng)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性菌株粗提物不抑制硅藻的生長，但是影響硅藻細(xì)胞在生物膜和懸浮狀態(tài)的分布。粗提物處理使硅藻Stauroneis sp.形成生物膜的細(xì)胞比例降低，但對Amphora sp.的細(xì)胞分布影響不大;硅藻EPS分布的變化與硅藻細(xì)胞在培養(yǎng)體系中分布的變化一致;粗提物改變單位硅藻細(xì)胞EPS的分泌量，高濃度處理使Stauroneis

11、sp.每克干藻的EPS產(chǎn)量大幅上升，而高濃度處理下Amphora sp.的每克干藻的EPS產(chǎn)量與對照持平。兩種硅藻都出現(xiàn)單位藻細(xì)胞的生物膜TB-EPS增加，推測可能硅藻為了保持附著狀態(tài)，需要產(chǎn)生大量的緊密粘附性EPS來對抗干擾;兩種硅藻對粗提物處理的反應(yīng)程度受硅藻本身生活型的影響。
　　4、將兩種硅藻的EPS粗品進(jìn)行有機(jī)溶劑洗滌去脂、Sevage法去蛋白、透析除鹽后，經(jīng)TFA完全酸水解，經(jīng)PMP柱前衍生化，利用HPLC方法分析EP

12、S的單糖組成并計算各單糖的分子摩爾比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種生活型不同的硅藻EPS的單糖組成不同。硅藻Stauroneissp.的EPS由9-10種單糖組成，總EPS含有9種單糖。按照出峰順序依次是Man、Glc-N、Rha、Glc-A、Glc-NAC、Glc、Gal、Xyl和Fuc，不含Gal-A和Ara。Amphora sp.的總EPS由12種單糖組成，除了包含Stauroneis sp.所有的9種單糖和Gal-A外，還含有兩種未知單糖。從

13、單糖種類數(shù)上看，Amphora sp.比Stauroneis sp.的EPS單糖種類豐富。同一種硅藻不同來源的EPS優(yōu)勢單糖不同。硅藻Stauroneis sp.的細(xì)胞外粘附性EPS(TB-EPS)，來自懸浮細(xì)胞的F-TB-EPS和來自生物膜細(xì)胞的BF-TB-EPS，兩者的第一優(yōu)勢單糖都是Glc，占比分別達(dá)到38％和59％。但是，F(xiàn)-TB-EPS的第二優(yōu)勢單糖是Gal，而BF-TB-EPS的第二優(yōu)勢單糖則是Man。硅藻Amphora s

14、p.懸浮細(xì)胞的TB-EPS占優(yōu)勢的單糖是Xyl，而生物膜細(xì)胞的TB-EPS優(yōu)勢單糖有三種，分別是Man、Glc-A和Gal，三者占比相當(dāng)。不同硅藻的EPS差異明顯，但來源相似的EPS具有一定的相似性?？扇苄訣PS(SL-EPS)來自于全部細(xì)胞，兩種硅藻Stauroneis sp.和Amphora sp.的SL-EPS均以Xyl和Glc-A為主要單糖。
　　兩種硅藻在對活性菌株粗提物的反應(yīng)中，變化最小的EPS都是來自全部硅藻細(xì)胞的可

15、溶性EPS(SL-EPS)。無論粗提物濃度高低，該部分EPS的優(yōu)勢單糖均沒有發(fā)生變化，僅僅是優(yōu)勢單糖的占比發(fā)生一些變化。從各個部位的EPS總體來看，Stauroneis sp.有4種特征單糖，分別是Xyl、Glc、Man和Gal，全部都是中性單糖;Amphora sp.有5種特征單糖，分別是Xyl、Gal、Man，還有Glc-A和GlcN，除了中性單糖，還有糖醛酸和葡萄糖胺。一般情況下，優(yōu)勢單糖往往是粗提物處理引起變化發(fā)生的熱點位置，但

16、是也有非優(yōu)勢單糖受到處理后發(fā)生明顯變化，而成為熱點位置的情況。
　　關(guān)于硅藻附著性能和單糖組成之間的關(guān)系的分析表明，附著性能強(qiáng)的硅藻Amphora sp.的EPS中“氨基己糖+糖醛酸”、糖醛酸、Glc-A的摩爾百分含量均高于附著性能弱的硅藻Stauroneis sp.。尤其是Glc-A，在附著性能強(qiáng)的Amphora sp.的EPS中是優(yōu)勢單糖，在附著性能弱的硅藻Stauroneis sp.中摩爾百分含量相對較低。當(dāng)進(jìn)行活性菌株粗提