羅氏公司tunel細胞凋亡檢測程序

1、羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序（InsitucelldeathdetectionkitPOD法）原理：原理：TUNEL（TdTmediateddUTPnickendlabeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’OH末端，并與連接辣根過氧化酶（H

2、RP，hseradishperoxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色

3、法確定細胞死亡類型和分化階段。器材與試劑器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑：試劑盒含TdT10、熒光素標記的dUTP1、標記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5μl20DAB1μL30%H2O294μlPBS）、ProteinaseK工作液（1

4、020μgmlin10mMTrisHCl，pH7.48）或細胞通透液（0.1%TritonX100in0.1%sodiumcitrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase1（3000Uml–3Umlin50mMTrisHCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mgmlBSA）等。、實驗步驟實驗步驟操作流程圖：操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converterPOD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)

5、顯微鏡計數(shù)并拍照。具體操作步驟：具體操作步驟：1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；3.PBS漂洗2次；4.用ProteinaseK工作液處理組織1530min在21–37C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速

6、進行脫水操作。7.熒光素標記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。8.試劑保存；未打開的試劑盒貯存在20℃（15~25℃）；converterPOD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。9.結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡