植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定

1、實(shí)驗(yàn)6植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定硝酸還原酶（nitratereductaseNR），是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽（NO3ˉNADHH＋→NO2ˉNAD＋H2O）。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或?qū)ΘC氨基苯磺酰胺）及α萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下：生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮

2、重以Nμg／（gh）為單位。NR的測定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。Ⅰ離體法二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料水稻、小麥葉片、幼穗等。（二）試劑1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純NaNO20.9857g溶于無離子水后定容至1000mL，然后再吸取5mL定容至1000mL，即為含亞硝態(tài)氮的1μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液。20.1molLpH7.5的磷酸緩沖液：Na2HPO412H2O30

3、.0905g與NaH2PO42H2O2.4965g加無離子水溶解后定容至1000mL。31％磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100mL3molLHCl中（25mL濃鹽酸加水定容至100mL即為3molLHCl）。40.02％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL無離子水中，貯于棕色瓶中。單位鮮重樣品中硝酸還原酶活性=[μg／（gh）]式中：X——反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量，μg。Vl——提取酶時(shí)加入的緩沖液體積，mL。V2

4、——酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積，mL。W——樣品鮮重，g。t——反應(yīng)時(shí)間，h。Ⅱ活體法一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料植物的新鮮葉片（豌豆、王米、小麥、大豆等）。（二）試劑1.1%磺胺試劑：1.0g磺胺溶于100mL3molLHCl中（25mL濃鹽酸加水定容至100mL即為3molLHCl）。2.α萘胺試劑：稱取α萘胺0.2g，用含1mL濃鹽酸的蒸餾水溶解，再用蒸餾水稀釋至100mL。3.NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液：稱取0.1gNaNO2

5、，用蒸餾水溶解，定容至100mL。之后，再吸出5mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。此液每毫升含有5μgNaNO2，用時(shí)再稀釋。4.0.2molLKNO3：稱取KNO32.002g，用蒸餾水溶解，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。5.0.1molL磷酸緩沖液，pH7.5。（三）儀器設(shè)備三角瓶50mL，打孔器（直徑0.5cm），真空泵，溫箱，分光光度計(jì)，移液管5mL3個(gè)，1mL2個(gè)，2mL2個(gè)，臺天平1臺。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.繪制標(biāo)

6、準(zhǔn)曲線（1）把每毫升含有5μg的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成每毫升含有0.5，1.0，2.0、3.0、4.0μgNaNO2溶液。（2）取6支試管，1支裝入蒸餾水1mL，另5支分別裝入上述不同濃度的NaNO2溶液1mL，然后向每支試管里加入磺胺試劑2mL及α萘胺試劑2mL，搖勻，在25～30℃條件下保溫1h，冷卻后于分光光度計(jì)在540nm波長下比色，讀出光密度。以光密度為縱坐標(biāo)，NaNO2濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的測定（1）從田間