mirrna的定量實驗方案

1、1、實驗目的：RD細胞定量檢測miR188miR6572、實驗材料及試劑：超凈臺（上海凈化設備廠）生物安全柜（ESCO，Singape）細胞培養(yǎng)箱（Heraeus，Germany）分光光度儀（Eppendf，Germany）PCR儀（Eppendf，Germany）冷凍離心機（Eppendf，Germany）移液槍（Eppendf，Germany），（realtime試劑盒（takara），顯微(coic重慶光學儀器廠），計數(shù)板；異丙醇

2、（上?；瘜W試劑有限公司），八連管；100%乙醇（上海化學試劑有限公司）細胞培養(yǎng)液（Gibco，USA），氯仿（上?；瘜W試劑有限公司）EDTA胰酶（Gibco，USA）Trizol（Invitrogen，USA）三、實驗過程（1）RD細胞的收集1.培養(yǎng)傳代RD細胞，待細胞生長狀態(tài)良好，密度約80%時進行收集；2..倒掉細胞培養(yǎng)液，加入1ml的胰酶于培養(yǎng)瓶中，混勻后將其吸掉（防止消化過度)靜置，在顯微鏡下觀察細胞開始變圓（細胞成流沙狀流下時

3、）；.加入1ml的培養(yǎng)液，吹打混勻，對其進行細胞計數(shù)，按照公式（四個大方格4)104稀釋的倍數(shù)=細胞原液量ml.記錄數(shù)據(jù)。取出200ul的該細胞懸液于經(jīng)DEPC處理的EP管中。（2）Trizol抽提總RNA1.取出上步所收集到的細胞懸液。2.加入1mlTrizol，顛倒34次，室溫靜置10min。3.每1mlTrizol加入0.2ml氯仿劇烈震蕩15sec，室溫放置5min。4.4℃，12000g低溫離心15min，此時樣品分為三層：上

4、層為無色水相，中間層為白色底層為黃色有機相。5.吸約650ul的上清液于新的Eppendf管。6.加入等體積650ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下20min(20℃沉淀1小時以上)。7.4℃，12000g低溫離心15min。8.去上清，加入1ml75%乙醇，4℃，10000g低溫離心8min，重復一次。9.倒掉乙醇，自然晾干，不可用太大力；室溫放置5～10min干燥RNA沉淀。10.用含有1UμlRNA酶抑制劑的水20μl溶解。11.收集

5、標記提取出的RNA待用；（3）RT1.注意：做之前要用分光光度儀測定RNA的量；水的量要根據(jù)實驗的具體情況來加，使得最后反應體系是10ul。在此步的同時要做內參5sRNA的逆轉錄3.要用到六排八連管，每三排為一組，分別測定miR188a3p和miR657。樣本做兩排，做復孔，每一排的第一孔加水做陰性對照；前兩排的其余七孔按照上圖稀釋的倍數(shù)按順序加入不同稀釋度的樣本反應液；第三排的其余七孔加內參5sRNA的不同稀釋度的反應液，同樣的順序。