第六章--放射免疫實(shí)驗(yàn)

1、第三章 放射免疫分析技術(shù),體外放射分析技術(shù),利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進(jìn)行體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測(cè)定。,競(jìng)爭(zhēng)性放射分析——放射免疫分析（RIA）非競(jìng)爭(zhēng)性放射分析——免疫放射分析（IRMA）,,,,待測(cè)物質(zhì)濃度與檢測(cè)手段,臨床化學(xué)分析,,,,,,,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Al

2、lergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用,放射免疫分析的創(chuàng)立,1959 美國Yalow & Berson1960 英國 Ekim’s1977 獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎(jiǎng),醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析的里程碑,1959年，Y

3、alow和Berson創(chuàng)立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。這種方法結(jié)合了放射性核素測(cè)量的高靈敏性和免疫抗原-抗體反應(yīng)的高特異性兩大特點(diǎn)，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測(cè)定技術(shù)的先河。,女科學(xué)家 R.Yalow,放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）,基本原理,Ag + Ab Ag-Ab + Ag*

4、 Ag*-Ab,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合：放射性標(biāo)記的抗原（Ag*）和非標(biāo)記的抗原（Ag）在同一反應(yīng)系統(tǒng)中與特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。,,,,,,,在上反應(yīng)式中：Ag與Ag*的免疫活性相同，即與Ab有相同的親和力；Ab的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*；Ag*與Ab的量是恒定的，Ag是待測(cè)量。,二種抗原(Ag 、Ag*)與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比例，Ag量多，則AgAb結(jié)合多，Ag*Ab結(jié)合量就少，即Ag*Ab將隨Ag的

5、增加而減少，呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為函數(shù)關(guān)系。在系統(tǒng)中，Ag*Ab的量可通過測(cè)定放射性而獲得，再根據(jù)函數(shù)關(guān)系求Ag的量。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,+,,,,,+,,,,,,,+,,,,,,,,Bound,Free,A

6、g,Ab,標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線又稱為劑量反應(yīng)曲線，以一系列遞增濃度的Ag及一定量的Ag*與恒定量限量的Ab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)而得，是對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。,標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例,,標(biāo)準(zhǔn)曲線:,① 配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測(cè)定*Ag-Ab的放射性B。②B0為標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度=0時(shí)的放射性值。,放免分析基本條件,（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原（二）特異性抗體（三）標(biāo)記抗原（四）

7、分離技術(shù),a. 概念：是指已知真實(shí)含量，且不含對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生干擾雜志的抗原。b. 用途： 免疫動(dòng)物制備抗體——Ab 放射性核素標(biāo)記——Ag* 繪制劑量反應(yīng)曲線c. 要求： 高純度 高準(zhǔn)確度 良好的穩(wěn)定性,（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原,（二）特異性抗體,a. 對(duì)特異性結(jié)合抗體的要求：1．親和力 （affinity）高：指單個(gè)抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合

8、的能力，用 親和常數(shù)Ka 值表示，反映靈敏度，Ka應(yīng)達(dá)109~1012mol/L。2．特異性高：與待測(cè)抗原的結(jié)合力高，而與待測(cè)抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)率）低。3．滴度 （效價(jià)）高：指將血清稀釋時(shí)能與抗原發(fā)生反應(yīng)的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價(jià)越高。4．穩(wěn)定性好：能長期保存，化學(xué)性質(zhì)、效價(jià)穩(wěn)定。,b. 抗血清的制備：1.大分子物質(zhì)可直接免疫動(dòng)物誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但是

9、小分子物質(zhì)為半抗原，必須與載體結(jié)合制成人工抗原（半抗原-蛋白質(zhì)），才能進(jìn)行免疫。2．選擇合適的免疫動(dòng)物：兔、鼠、羊。3．應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油 +卡介苗）。4．選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點(diǎn)）、間隔時(shí)間（加強(qiáng)）與次數(shù)。,c.單克隆抗體的使用：,特異性高 親和力低，不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體,對(duì)標(biāo)記抗原的要求：1．放射性比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強(qiáng)度高，一

10、般至少達(dá)到370GBq/mmol。2．免疫活性：與標(biāo)記前一致。3．放射化學(xué)純度高：應(yīng) > 95%。4．穩(wěn)定性好：標(biāo)記的同位素不易脫落。,（三）標(biāo)記抗原,常用標(biāo)記核素：（1）125I： γ 射線，半衰期 60 天（2）3H： β 射線，半衰期 12.3 年測(cè)量?jī)x器：（1）γ 計(jì)數(shù)儀（2）β液體閃爍計(jì)數(shù)器,兩種標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn),3H標(biāo)記物 125I 標(biāo)記物 貨架期

11、長 貨架期短以3H置換H，對(duì)原物質(zhì) 以125I取代H，可能影響 免疫活性無改變 免疫活性 標(biāo)記難度大，比活度低 標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，比活度高 Β射線測(cè)量效率低 γ射線測(cè)量效率高 廢棄物處理較困難

12、 廢棄物處理較容易,a. 對(duì)分離方法的要求：1．使抗原-抗體復(fù)合物（B）與游離抗原（F）盡可能分離完全；2．分離后便于放射性測(cè)量；3．分離效果不受外界干擾因素的影響；4． 操作簡(jiǎn)便、分離迅速、重復(fù)性好；5．與游離標(biāo)記物的非特異性結(jié)合盡可能??；6. 試劑來源廣泛、價(jià)格低廉。,（四）分離技術(shù),b. 常用的分離方法 1. 雙抗體法特點(diǎn)： 分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但分離時(shí)間長，成本高

13、。,2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）特點(diǎn)： 快速，價(jià)廉，來源方便，受環(huán)境影響大3. 雙抗體PEG法將雙抗體和沉淀法兩者結(jié)合進(jìn)行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，并克服了雙抗體分離時(shí)間長和沉淀法非特異性結(jié)合高的缺點(diǎn)。,4．固相分離法將抗體通過特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應(yīng)在固相載體上完成，達(dá)到平衡后形成固相的Ag-Ab 復(fù)合物，可與游離部分分離。此方法具有操作簡(jiǎn)便，迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低等優(yōu)

14、點(diǎn)。,,,5.磁化分離法6.葡萄球菌A蛋白分離法（SPA分離法） 7. 微孔濾膜法,放免分析的優(yōu)點(diǎn),靈敏度高特異性強(qiáng)精確度高用血量少缺點(diǎn)：污染；放射性核素衰變及不穩(wěn)定,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用,1968年，Miles和Hales創(chuàng)立了免疫放射分析法（IRMA）。IRMA與IRA不同，它是將放射性核素標(biāo)記在抗體上，而不是標(biāo)記在抗原上。同時(shí)所用的標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原比較是過量的。

15、 Ag+Ab* Ag-Ab*+Ab* B F由上式可見， IRMA不存在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，是待測(cè)抗原直接與標(biāo)記抗體反應(yīng)。待測(cè)抗原的量與抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的量成正相關(guān)關(guān)系。,免疫放射分析法（immunoradiometric assay，IRMA）,,,1.單位點(diǎn)IRMA,單位點(diǎn)（one-site）IRMA是利用過量的標(biāo)記抗體（Ab*）與待測(cè)抗原（Ag）進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，

16、形成抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，再用固相抗原免疫吸附劑（SP-Ag）與剩余的標(biāo)記抗體結(jié)合，并將其分離。,2.雙位點(diǎn)IRMA,將抗體1結(jié)合于固相表面，加入標(biāo)本后，待測(cè)抗原與固相抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，并留在固相表面。洗去其他物質(zhì)后，加入標(biāo)記抗體2，在固相表面形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，再洗去多余標(biāo)記抗體，即可達(dá)到分離目的。,競(jìng)爭(zhēng)性分析與非競(jìng)爭(zhēng)分析的比較,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用,放射免

17、疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用,一 甲狀腺疾病二 代謝類疾病三 骨和礦物質(zhì)代謝四 腫瘤五 心血管疾病六 器官移植中的藥物監(jiān)控,一 甲狀腺疾病,TSH 促甲狀腺激素STSH 高靈敏度甲狀腺激素FT3 血清游離三碘甲狀腺原氨酸 FT4 游離甲狀腺素 TgAb 抗甲狀腺球蛋白抗體TmAb抗甲狀腺微粒體抗體,臨床上確診為甲狀腺功能亢進(jìn)的步驟,臨床上確診為甲狀腺功能減退的步驟,二 代謝類疾病,胰島素原（proinsulin）正常生理?xiàng)l

18、件下，胰島素原分子釋放很少，占總分泌5%-10%，因此不考慮其對(duì)胰島素測(cè)定的影響。在病理情況下，如胰島素瘤，血中胰島素原可達(dá)50%-70%。目前，市場(chǎng)上已有用純胰島素原做為標(biāo)準(zhǔn)品的放免藥盒，可用來直接測(cè)定血清或血漿中的胰島素原含量。,人真胰島素(insulin specific)不經(jīng)處理的血漿，通過放免法測(cè)得的胰島素稱為免疫反應(yīng)性胰島素（IRI），IRI與胰島素原有明顯的交叉反應(yīng)，當(dāng)血清中胰島素原含量較高時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)胰島素測(cè)定的影響。

19、人真胰島素放免分析可特異性測(cè)定人血清中與胰島素原無交叉反應(yīng)的胰島素水平，是確切評(píng)價(jià)β細(xì)胞功能和胰島素敏感性的關(guān)鍵指標(biāo)。,三 骨和礦物質(zhì)代謝,1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D體內(nèi)維生素D經(jīng)日光紫外線照射、且在C1和C25位羥基化后，才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘木S生素D代謝物。測(cè)定血清中1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D的濃度可鑒別與維生素代謝有關(guān)的疾病。目前國內(nèi)用維生素D放免藥盒用于維生素D缺乏癥、骨營養(yǎng)不良、肝炎和藥物性維生素

20、D紊亂、甲狀旁腺功能亢進(jìn)或減退的測(cè)定。,降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）CT及PTH參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制：當(dāng)血鈣降低時(shí)，PTH分泌增加，作用于骨促進(jìn)溶骨，鈣自骨釋出，同時(shí)作用于腎使腎小管對(duì)鈣回吸增多。血鈣上升則刺激甲狀腺分泌CT抑制骨鈣釋放，同時(shí)促進(jìn)腎小球?qū)︹}的排出。CT和PTH的分泌功能彼此成反饋關(guān)系，機(jī)體通過它們互相拮抗作用維持代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。降鈣素和甲狀旁腺激素對(duì)鈣代謝的調(diào)節(jié)不僅取決于它們?cè)谘泻康慕^對(duì)值，更重要是它們

21、的比值。因此測(cè)定它們的比值對(duì)內(nèi)分泌代謝病研究很有價(jià)值。,骨鈣素（OC）骨鈣素由成骨細(xì)胞合成，在合成過程中不斷有少量骨鈣素釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，骨鈣素的水平直接反映骨骼生成狀況，其檢測(cè)可以幫助評(píng)價(jià)骨骼更新程度，高水平的骨鈣素與骨代謝病相關(guān)。整分子骨鈣素放免藥盒（intact OC IRMA kit）可以用于軟骨病、Paget骨病、甲狀腺功能亢進(jìn)、腎性營養(yǎng)不良、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的檢測(cè)。,四 腫瘤,甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白作為一種腫瘤特異

22、性抗原，對(duì)早期診斷原發(fā)性肝癌具有較高靈敏性和特異性。陽性率在60%~85%。癌胚抗原（CEA）癌胚抗原首先是從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，癌胚抗原升高和消化道腫瘤密切相關(guān)。胃癌患者陽性率可高達(dá)50%以上。,糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）CA50——胰腺癌、肝癌、結(jié)、直腸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肺癌、食道癌。CA19-9——對(duì)胰腺癌和膽囊癌診斷有較高特異性，陽性率＞80%，絕對(duì)值升高明顯

23、。CA125——非粘液性卵巢癌診斷特異性強(qiáng)。CYFRA21-1——肺癌的診斷和療效觀察。,五 心血管疾病,內(nèi)皮素（ET） ET是一種內(nèi)皮細(xì)胞來源的血管活性多肽，主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有強(qiáng)大的縮血管和促血管平滑肌細(xì)胞增殖作用。與冠心病發(fā)生密切相關(guān)。急性心肌梗死和高血壓患者血中ET水平明顯增高。,肌紅蛋白（Mb）Mb廣泛分布于心肌和骨骼肌中，正常人血中含量低。當(dāng)心肌和骨骼肌發(fā)生損傷時(shí)，血中Mb含量明顯升高?，F(xiàn)已將Mb測(cè)定廣泛用于

24、心肌梗死診斷、預(yù)后判斷及病情監(jiān)測(cè)。正常參考值RIA為6~85ng/ml，男性高于女性。心肌鈣蛋白T（TnT）TnT是心肌細(xì)胞收縮器結(jié)構(gòu)蛋白的一種，正常人血清中幾乎測(cè)不到，而心肌梗死病人呈不同程度升高。 TnT檢測(cè)能敏感發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞損害。對(duì)診斷有價(jià)值。,六 器官移植中的藥物檢測(cè),環(huán)孢素（Cyclosporine ）環(huán)孢素是器官移植中最常用的免疫抑制劑。病人對(duì)藥物的吸收有個(gè)體差異。美國DiaSorin公司提供的環(huán)孢素放免藥盒，可以確定