藥品微生物檢驗特點及過程控制

1、中國藥品生物制品檢定所,1,藥品微生物檢驗特點及過程控制,藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗,,,,,方法驗證,過程控制,中國藥品生物制品檢定所,2,無菌/微生物限度檢查理念,,,,,中國藥品生物制品檢定所,3,微生物檢查的過程控制,一、實驗設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）二、檢驗程序（軟件——有效的結(jié)果）三、結(jié)果判斷（調(diào)查——可靠的結(jié)論）,中國藥品生物制品檢定所,4,一、實驗設(shè)施,實驗室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對照培養(yǎng)基,

2、,物 質(zhì) 保 障,中國藥品生物制品檢定所,5,（一）、實驗室系統(tǒng),潔凈實驗條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境?？刹僮餍裕悍奖?、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護(hù)、驗證陽性菌實驗室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn),中國藥品生物制品檢定所,6,實驗室改造示例：原布局圖 擬定布局圖

3、 建議布局圖1 建議布局圖2實驗室系統(tǒng)——中檢所微生物實驗室,,中國藥品生物制品檢定所,7,（一）、實驗室系統(tǒng),實驗室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)的有效性 壓差、風(fēng)速、微粒、照度 （外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物,中國藥

4、品生物制品檢定所,8,環(huán)境菌庫,潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus luteus）,中國藥品生物制品檢定所,9,（

5、二）、操作環(huán)境,1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺,中國藥品生物制品檢定所,10,（二）、操作環(huán)境,,,中國藥品生物制品檢定所,11,搽拭,菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于 99%,中國藥品生物制品檢定所,12,（三）、關(guān)鍵設(shè)備,微生物檢查薄膜過濾儀 一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器,中國藥品生物制品檢定所,13,（四）、對照培養(yǎng)基,培養(yǎng)基適用性（靈敏度）； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（

6、標(biāo)準(zhǔn)化）。,對照培養(yǎng)基,理化評價（可控性）,生物學(xué)評價（有效性）,回收率比較,MPN比較,生長曲線比較,生態(tài)評價,,,,某些CRS原則,固態(tài)培養(yǎng)基,液態(tài)培養(yǎng)基,,,瓊脂加減法,,,,,,,,,,,中國藥品生物制品檢定所,14,二、檢驗程序,中國藥品生物制品檢定所,15,二、檢驗程序,接受任務(wù)實驗方案實驗準(zhǔn)備樣品核對實驗操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察,,有效的結(jié)果,物 質(zhì) 保 障,,中國藥品生物制品檢定所,16,實驗室管理規(guī)范（軟件）,

7、中檢所抗生素室微生物實驗室質(zhì)量管理體系編寫說明及批準(zhǔn)頁1 實驗室概況1.1 實驗室簡介 1.2 實驗室通訊資料 1.3 實驗室認(rèn)可項目/參數(shù)表1.4 實驗室平面圖及功能區(qū)域 1.5 儀器設(shè)備總覽1.6 常備試劑耗材一覽表1.7 實驗室發(fā)展目標(biāo)2 管理規(guī)范2.1 安全管理2.2 業(yè)務(wù)流程2.3 人員管理（6個SOP）2.4 樣品管理（3個SOP）3 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1 檢驗工作

8、SOP（13個）3.2 儀器操作SOP（30個）3.3 實驗記錄SOP（9個）4 實驗室保障4.1 實驗室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則4.2 實驗室設(shè)施服務(wù)商4.3 實驗設(shè)備供應(yīng)商4.4 實驗室消耗品供應(yīng)商,中國藥品生物制品檢定所,17,（一）、實驗準(zhǔn)備,實驗準(zhǔn)備應(yīng)堅持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患，應(yīng)隨時保證“來之能戰(zhàn)” 。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材

9、等。,中國藥品生物制品檢定所,18,實驗準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備實驗準(zhǔn)備——場地清潔實驗準(zhǔn)備——臺面清潔,中國藥品生物制品檢定所,19,（二）、樣品核對,盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細(xì)核對樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實驗、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。,中國藥品生物制品檢定所,20,樣品外觀檢查——欣弗樣品外觀檢查——刺

10、五加樣品外觀檢查——雙黃連樣品完整性真空檢漏,中國藥品生物制品檢定所,21,（三）、實驗操作,不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實驗室污染。,藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié),藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié),中國藥品生物制品檢定所,22,實驗操作——物料進(jìn)場,消毒液搽拭物品外表面,潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）,雙層無菌包裝,,核心區(qū),外圍,實驗操作——人員進(jìn)場,一更,二更,核心操作區(qū),實驗操作——無

11、菌操作技術(shù),中國藥品生物制品檢定所,23,（四）、實驗過程監(jiān)控,樣品監(jiān)控,手指監(jiān)控,沉降菌監(jiān)控,無菌檢驗框架示意圖,中國藥品生物制品檢定所,24,三、結(jié)果判斷,長菌與否分離鑒定溯源調(diào)查結(jié)果報告,,可靠的結(jié)論,有效的結(jié)果,物 質(zhì) 保 障,,,中國藥品生物制品檢定所,25,三、結(jié)果判斷,是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物來自哪里？ 幾點思考 參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)

12、境菌的相似性考 察》《藥學(xué)學(xué)報》，2007，42（11）：1189～1194 《判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實驗探討》《藥物分析雜志》， 2008， 28（05）：66～71,中國藥品生物制品檢定所,26,1、長菌與否？,渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？,一靠經(jīng)驗二靠實驗三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾,中國藥品生物制品檢定所,27,是不是微生物？,（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物

13、理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？,中國藥品生物制品檢定所,28,菌落or藥渣？,經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗延長培養(yǎng)時間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢,中國藥品生物制品檢定所,29,2、分離鑒定,（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血

14、瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。,中國藥品生物制品檢定所,30,是什么微生物？,宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、DNA） ……,中國藥品生物制品檢定所,31,3、溯源調(diào)查,樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)

15、期）現(xiàn)場調(diào)查收集菌株,,鑒定與相似性分析相結(jié)合,傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合,不同方法的交叉驗證,中國藥品生物制品檢定所,32,微生物來自哪里？,相似性分析 同源性分析 脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）,中國藥品生物制品檢定所,33,Sample Preparation,Automated measurement after drying of the samples!,2. Suspending,1. Ha

16、rvesting,3. Loading,FT-IR Spektrum of microorganisms,圖 不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系,中國藥品生物制品檢定所,34,The Infrared Spectrum,FT-IR spectrum is a fingerprint of the cells,Biochemical Structure of Cells,中國藥品生物制品檢定所,35,中國藥品生物制品檢定所,36,溯源性

17、分析例1——欣弗事件,圖29 欣弗培養(yǎng)物,圖30 欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢,中國藥品生物制品檢定所,37,中國藥品生物制品檢定所,38,溯源性分析例1——欣弗事件,頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus capitis ssp capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Sta

18、phylococcus cohnii ssp cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。,監(jiān)測到的環(huán)境菌株,中國藥品生物制品檢定所,39,溯源性分析例2,,,,,,,,,,,,,雙黃連注射液,利巴韋林注射液,FTIR相似性分析,DuPont RiboPrinter基因指紋分析,,,,,,,,中國藥品生

19、物制品檢定所,40,幾點思考,（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認(rèn)識微生物本身 微生物變異與保守的相對性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學(xué)先鋒琳恩·馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。,中國藥品生物制品檢定所,41,幾點思考,（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 需要深入認(rèn)識分析微生物的技術(shù)和手段 形態(tài)學(xué)分析與

20、相似性分析（生化反應(yīng)譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權(quán)衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎(chǔ)上，似乎更適合對親緣關(guān)系下一個否定的結(jié)論，即排除法，在這個意義上是否可以引入化學(xué)分析的3δ概念、精密度概念？,中國藥品生物制品檢定所,42,4、幾點思考,（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNA cDNA序列水平

21、具有確定意義，困難在于確定足夠長。 溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對菌株的穩(wěn)定性認(rèn)識？與之相關(guān)的技術(shù)粗放性問題。,中國藥品生物制品檢定所,43,4、幾點思考,（3）、怎樣下結(jié)論？ 分析的根本目的是要下一個結(jié)論 以檢驗活動為中心、以檢驗過程為線索、以實 驗事實為依據(jù)，根據(jù)所有信息的綜合分析能力。 對陽性檢出菌的技術(shù)分析最終要回到檢驗活動本身，技術(shù)分析結(jié)論,中國藥品生物制品檢定所,44,4、結(jié)果報告,綜合分析慎下