2014-免疫學(xué)檢驗(yàn)與臨床應(yīng)用

1、免疫學(xué)檢測(cè)原理及臨床應(yīng)用,郭 繼 強(qiáng),新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,免疫學(xué)檢驗(yàn)是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測(cè)定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)，在疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛。,細(xì)胞水平檢測(cè),第一節(jié) 免疫學(xué)檢驗(yàn)原理,基因水平檢測(cè),分子水平檢測(cè),一、免疫細(xì)胞的檢測(cè),對(duì)機(jī)體參與免疫應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)行分離、純化、鑒定、計(jì)數(shù)及功能測(cè)定。,外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離（Peripheral blood mononuclear ce

2、ll,PBMC) T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離 DC、NK、Mφ的分離,密度梯度離心(Ficoll)離心,（泛影酸葡甲胺-聚蔗糖）,E花環(huán)沉降法 ：分離T細(xì)胞（CD2-綿羊紅細(xì)胞）尼龍毛柱分離法 ：分離T或B細(xì)胞（B細(xì)胞尼龍毛的粘附力）。貼壁法：分離Mφ,利用細(xì)胞的吸附特性,利用細(xì)胞表面標(biāo)志,T細(xì)胞：CD3，CD4，CD8,B細(xì)胞：CD79，CD19，CD5,NK：CD56+、CDl6,DC：CD11c，CD86,Mφ：CD11b，CD

3、86，CD83,親和版結(jié)合分離法,流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）,采用激光作為激發(fā)光源；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。,流式細(xì)胞儀工作原理,細(xì)胞1,細(xì)胞2,,Ag1,Ag2,,,流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性,,,流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)分析,免疫磁珠分離immunomagnetic beads,磁珠抗體,免疫磁珠分離的正選法和負(fù)選

4、法,抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù),,親和素,抗原肽,MHC I,生物素,熒光素,淋巴細(xì)胞的功能檢測(cè),淋巴細(xì)胞功能測(cè)定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是間接了解淋巴細(xì)胞對(duì)抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對(duì)抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測(cè)定,T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn),1. 原理：,淋巴細(xì)胞,,DNA合成,分化,,,,母細(xì)胞,刺激物,,,,,,,,,細(xì)胞變大,細(xì)胞漿擴(kuò)大,空泡,核

5、仁明顯,核染色質(zhì)疏松,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物,非特異性刺激物： PHA ------T細(xì)胞 ConA -------T細(xì)胞 PWM -------T、 B細(xì)胞 LPS -------B細(xì)胞特異性刺激物： 異種抗原 同種組織抗原,形態(tài)學(xué)檢查法,2. 方法：

6、,細(xì)胞漿，增大，可見空泡；細(xì)胞核增大，偏一側(cè)，核松散，可見核仁。,核仁,3H-TdR摻入法,T細(xì)胞殺傷功能測(cè)定,細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr(鉻)釋放法,CTL,+,,MTT實(shí)驗(yàn) MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。 MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀

7、酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,MTT增殖實(shí)驗(yàn),MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果,吸光度,細(xì)胞數(shù),體內(nèi)試驗(yàn),特異性抗原皮膚試驗(yàn)抗原：結(jié)核菌素（OT）植物血凝素（PHA）,二、B細(xì)胞功能檢測(cè),B細(xì)胞增殖能力的

8、試驗(yàn)溶血空斑試驗(yàn)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測(cè)體內(nèi)試驗(yàn),,,,(一)B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn),細(xì)菌脂多糖,,,B細(xì)胞增殖,,形態(tài)學(xué),3H－TdR摻入法,,(二) 溶血空斑試驗(yàn),1. 原理：,,脾臟,綿羊紅細(xì)胞,綿羊紅細(xì)胞,3．臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià),溶血空斑試驗(yàn)主要用于測(cè)定藥物和手術(shù)等因素對(duì)體液免疫功能的影響評(píng)價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)Enzyme Linked ImmunoSPOT,1.ELISPOT技術(shù)起源與

9、發(fā)展,1983年, Czerkinsky&Sedgwick ：計(jì)數(shù)分泌抗體的 B 細(xì)胞；1985年，More：NC板，改進(jìn)顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠;1988年，Czerkinsky et.al.: 首次將應(yīng)用擴(kuò)展到細(xì)胞因子檢測(cè)領(lǐng)域，T cell IFN-γ; 同年業(yè)發(fā)展出雙色標(biāo)記技術(shù)；1995年，Schielen et.al.: 首次將PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Gui et.al.：發(fā)展出計(jì)算機(jī)輔助的

10、斑點(diǎn)技術(shù)技術(shù)。,用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（或B細(xì)胞分泌的抗體），并以斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。,3.ELISPOT技術(shù)原理,1.包被抗體 4℃ 過夜，洗滌；2.封閉37 ℃ 1h；3.加入淋巴細(xì)胞和刺激原37 ℃孵育8-40h；4.冰水裂解并移出細(xì)胞，洗滌；5.加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體37 ℃ 1h，洗滌；6.加入酶聯(lián)親和素37 ℃ 1h，洗滌；7.加入顯色底物，顯色10~40min；8.獲得斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)。,E

11、LISPOT一般操作流程,Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（透明板）,Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（PVDF板）,細(xì)胞吞噬功能測(cè)定,硝基藍(lán)四氮唑(NBT)試驗(yàn),吞噬細(xì)胞殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞可反映PMN的殺傷功能。,巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn),將待測(cè)Mφ與雞紅細(xì)胞混合溫育后，雞紅細(xì)胞被Mφ吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。,吞噬百分率=吞有紅細(xì)

12、胞的Mφ/Mφ總數(shù),1.反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。2.腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測(cè)。3.組織器官移植后對(duì)受者的細(xì)胞免疫學(xué)功能監(jiān)測(cè)則有利于排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時(shí)采取有效措施。4.單克隆抗體和細(xì)胞因子的生產(chǎn)。,免疫細(xì)胞功能檢測(cè)的臨床應(yīng)用,免疫標(biāo)記技術(shù),免疫熒光技術(shù) 放射免疫分析法 酶免疫技術(shù) 發(fā)光免疫測(cè)定,免疫酶測(cè)定法,夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋

13、梁,免疫組化技術(shù),定位、定性、定量檢測(cè),結(jié)腸癌CEA抗原染色,放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖,形態(tài)學(xué)檢測(cè)普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)熒光顯微鏡檢測(cè) 材料：①石蠟切片; ②冰凍切片; ③細(xì)胞涂片,細(xì)胞凋亡的檢測(cè),方法:電鏡觀察凋亡小體生化學(xué)方法免疫學(xué)方法末端標(biāo)記法,形態(tài)學(xué)方法： ① PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核紅色 ② DAPI染液；核藍(lán)色 ③ AO染液（

14、吖啶橙）：核黃綠色* 凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮, 染色加深,凋亡小體。,凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè),U937 Cell（DAP1染色）,大鼠結(jié)腸組織,DNA的斷裂,細(xì)胞的皺縮,在細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在DNA片段化之前，因而檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相

15、結(jié)合。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,生化學(xué)方法電泳法 DNA Ladder電泳圖譜,核小體,凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活, 核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)(缺口), 暴露出大量3-羥基末端, 如用(TdT)將標(biāo)記的-dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記, 則可原位特異地顯示出凋亡

16、細(xì)胞。 (一)熒光標(biāo)記法 (二)酶標(biāo)記法,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) (TdT或TUNEL),TUNEL染色原理,U937細(xì)胞（熒光素染色）,臨床意義--IgG 增高,多克隆性增高 見于各種慢性感染、慢性肝病、淋巴瘤、肺結(jié)核、鏈球菌感染以及自身免疫性疾病 單克隆性增高 僅見一種Ig增高，主要見于免疫增殖性疾病，如IgG分泌型多發(fā)性骨髓瘤,見于各種先天性和獲得性免疫缺陷病、聯(lián)合免疫缺陷病、也見于重鏈病、輕鏈病、腎病綜合癥、病

17、毒感染和免疫抑制劑患者,臨床意義--IgG 降低,IgA增高 見于IgA型MM（多發(fā)性骨髓瘤），SLE,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肝硬化，濕疹和腎臟疾病等 IgA降低 見于反復(fù)呼吸道感染，原發(fā)和繼發(fā)性免疫缺陷病和自身免疫性疾病,臨床意義--IgA,(1)增高：常見于一些急性時(shí)相反應(yīng)，如急性炎癥、傳染病早期、排異反應(yīng)、急性組織損傷。 (2)減低：見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期、大多數(shù)腎小球腎炎(如鏈球菌感染后腎小球

18、炎、狼瘡性腎炎、基底膜增殖性腎小球腎炎)、慢性活動(dòng)性肝炎、慢性肝病、肝硬化、肝壞死、先天性補(bǔ)體缺乏(如遺傳性C3缺乏癥)等。它們或是由于消耗或丟失過多或是由于合成能力降低造成。,臨床意義—補(bǔ)體C3,CD3 + CD4+減低 惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷、艾滋病、免疫抑制劑使用CD3+CD8+減低 自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病Th/ Ts 比值增高：自免、病毒感染、變態(tài)反應(yīng)減低：艾滋病（小于0.5），惡性腫瘤進(jìn)行期和復(fù)發(fā)時(shí),