dna提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理

1、DNADNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理1溶液溶液I—溶菌液溶菌液：溶菌酶溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β14β14糖苷鍵，因而具有糖苷鍵，因而具有溶菌的作用溶菌的作用。當(dāng)溶液中。當(dāng)溶液中pHpH小于小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖葡萄糖：增加溶液的粘度，：增加溶液的粘度，維持滲透壓維持

2、滲透壓，防止，防止DNADNA受機(jī)械剪切力作用而降解。受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTAEDTA：（：（1）螯合）螯合Mg2Mg2＋、＋、Ca2Ca2＋等金屬離子，＋等金屬離子，抑制抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)脫氧核糖核酸酶對(duì)DNADNA的降的降解作用（作用（DNaseDNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基輔基）（2）EDTAEDTA的存在，有利的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。于

3、溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。2溶液溶液IIII－NaOHNaOH－SDSSDS液：NaOHNaOH：核酸在：核酸在pHpH大于大于5，小于，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)?shù)?dāng)pHpH＞1212或pHpH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離氫鍵的解離而變性。而變性。在溶液在溶液IIII中的中的NaOHNaOH濃度為濃度為0.2mo10.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的，

4、加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pHpH就高達(dá)就高達(dá)12.612.6，因而促使染色體因而促使染色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA的變性。的變性。SDSSDS：SDSSDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚解聚細(xì)胞中的細(xì)胞中的核蛋白核蛋白。（3）SDSSDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為能與蛋白質(zhì)結(jié)

5、合成為ROSO3…RROSO3…R＋蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性而沉淀而沉淀下來(lái)。下來(lái)。但是但是SDSSDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中干凈，防止在下一步操作中（用（用RNaseRNase去除去除RNARNA時(shí)）受到干擾。時(shí)）受到干擾。3.3.溶液溶液III3molIII3mol／LNaAcNa

6、Ac（pH4.8pH4.8）溶液：）溶液：NaAcNaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pHpH至4.84.8，必須加入大量的冰醋酸。，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是所以該溶液實(shí)際上是NaAcHAcNaAcHAc的緩沖液。用的緩沖液。用pH4.8pH4.8的NaAcNaAc溶液是為了把溶液是為了把pH12.6pH12.6的抽提液，調(diào)回的抽提液，調(diào)回pHpH至中性，至中性，使變性的質(zhì)粒使變性的質(zhì)粒DNADNA能

7、夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol3mol／LNaAcNaAc有利于變有利于變性的大分子染色體性的大分子染色體DNADNA、RNARNA以及以及SDSSDS蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與后者是因?yàn)殁c鹽與SDSSDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，－蛋白復(fù)

8、合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。使沉淀更完全。4為什么用無(wú)水乙醇沉淀為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNADNA？用無(wú)水乙醇沉淀用無(wú)水乙醇沉淀DNADNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNADNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNADNA很安全，因此是理想的沉淀劑。很安全，因此是理想的沉淀劑。

9、DNADNA溶液是溶液是DNADNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNADNA周圍的周圍的水分子，使水分子，使DNADNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與倍體積的無(wú)水乙醇與DNADNA相混合，其乙醇的最終含量占相混合，其乙醇的最終含量占6767％左右。％左右。因而也可改用因而也可改用9595％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)

10、格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比9595％乙醇％乙醇昂貴）。昂貴）。但是加但是加9595％的乙醇使總體積增大，而％的乙醇使總體積增大，而DNADNA在溶液中有一定程度的溶解，因而在溶液中有一定程度的溶解，因而DNADNA損失也增大，損失也增大，基因組基因組DNADNACTABCTAB法CTABCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典配方TrisHClTrisHCl(pH8.0)(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境提供

11、一個(gè)緩沖環(huán)境防止核酸被破壞防止核酸被破壞EDTAEDTA螯合螯合Mg2Mg2或Mn2Mn2離子離子抑制抑制DNaseDNase活性活性NaClNaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境提供一個(gè)高鹽環(huán)境使DNPDNP充分溶解充分溶解存在于液相中存在于液相中CTABCTAB溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜并結(jié)合核酸并結(jié)合核酸使核酸便于分離使核酸便于分離ββ巰基乙醇是抗氧化劑巰基乙醇是抗氧化劑有效地防止酚氧化成醌有效地防止酚氧化成醌避免褐變避免褐變使酚容易去除使酚容易去除

12、基因組基因組DNADNACTABCTAB法CTABCTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP(PVP(聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物是酚的絡(luò)合物能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)有效去有效去除多酚除多酚減少減少DNADNA中酚的污染中酚的污染同時(shí)它也能和多糖結(jié)合同時(shí)它也能和多糖結(jié)合有效去除多糖有效去除多糖.基因組基因組DNADNA的提取核酸分離的提取核酸分離純化采用吸附材料吸附的方式分離

13、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNADNA時(shí)應(yīng)提供應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)(酚氯仿氯仿)抽提時(shí)應(yīng)充分混勻抽提時(shí)應(yīng)充分混勻但動(dòng)作要輕柔離心分離但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)兩相時(shí)應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組的去雜質(zhì)的方法基因組DNADNA的提取核酸分離的提取核酸分離純化純化蛋白質(zhì)的去除蛋白質(zhì)的去除:酚氯仿抽

14、提使用變性劑變性氯仿抽提使用變性劑變性(SDS(SDS異硫氰酸胍等異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離酶處理核酸分離純化純化多糖的去除多糖的去除:高鹽法高鹽法:用乙醇沉淀時(shí)用乙醇沉淀時(shí)在待沉淀溶液中加入在待沉淀溶液中加入1212體積的體積的5M5MNaClNaCl高鹽可溶解多糖高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(12(12體積體積))氯苯

15、可以與多糖的羥基作用氯苯可以與多糖的羥基作用從而去除多糖從而去除多糖.用PEG8000PEG8000代替乙醇代替乙醇沉淀沉淀DNA:DNA:在500500μLμLDNADNA液中加入液中加入200μl200μl20%20%PEG8000PEG8000(含1.21.2MNaCl)NaCl)冰浴20min.20min.核酸分離核酸分離純化純化多酚的去除多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:β:β巰基乙

16、醇巰基乙醇抗壞血酸抗壞血酸半胱半胱氨酸氨酸二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑:如PVP(PVP(聚乙烯吡咯酮聚乙烯吡咯酮)PEG()PEG(聚乙聚乙二醇二醇))它們與酚類有較強(qiáng)的親和力它們與酚類有較強(qiáng)的親和力可防止酚類與可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合鹽離子的去除鹽離子的去除:70%:70%的乙醇洗滌核酸吸附的乙醇洗滌核酸吸附沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸其它

17、的雜質(zhì)均被洗掉其它的雜質(zhì)均被洗掉達(dá)到純化達(dá)到純化DNADNA的目的另一種方式加入的目的另一種方式加入110110體積的體積的NaAc(pH5.23M)NaAc(pH5.23M)用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀RNARNA吸附或沉淀后應(yīng)用吸附或沉淀后應(yīng)用70%70%的乙醇的乙醇洗滌洗滌以除去鹽離子等若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用以除去鹽離子等若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TETE緩沖液溶解緩沖液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯合能螯合Mg

18、2Mg2或Mn2Mn2離子離子抑制抑制DNasepHDNasepH值為值為8.08.0可防止可防止DNADNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解?；蚪M基因組DNADNA提取常見(jiàn)問(wèn)題提取常見(jiàn)問(wèn)題DNADNA中含有蛋白中含有蛋白多糖多糖多酚類雜質(zhì)多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前在溶解前有酒精殘留有酒精殘留酒精抑制后續(xù)酶酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬離子有中殘留有金屬離子有RNARNA的存留原因?qū)Σ咧匦录兓拇媪粼驅(qū)Σ咧匦录兓疍NADNA

19、過(guò)吸附柱去過(guò)吸附柱去除蛋白除蛋白多糖多糖多酚等雜質(zhì)重新沉淀多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNADNA讓酒精充分揮發(fā)增加讓酒精充分揮發(fā)增加70%70%乙醇洗滌的次乙醇洗滌的次數(shù)(23(23次)加入加入RNaseRNase降解降解RNARNA問(wèn)題一問(wèn)題一:DNA:DNA樣品不純樣品不純抑制后續(xù)酶解和抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)反應(yīng).DNA.DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題材料不新鮮提取常見(jiàn)問(wèn)題材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈或反復(fù)

20、凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈DNADNA被機(jī)械打被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后研磨或勻漿組織后應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的料的DNADNA時(shí)可增加裂解液中螯合劑的含量可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)