第十四章維生素類藥物的分析

1、藥物分析,維 生 素 類 藥 物 的 分 析,第 十四 章,游 奎 一,湘 潭 大 學 化 工 學 院,公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來 的維A。 1600年-醫(yī)生鼓勵以多吃動物肝臟來治夜盲癥。 1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來的維C。1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。 1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

2、60;1911年-波蘭化學家豐克為維生素命名。 1915年-科學家認為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的1916年-維生素B被分離出來。,1920年-發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜轉(zhuǎn)化為維生素A。 1922年-維E被發(fā)現(xiàn)。 1928年-科學家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型。 1933年-維E首次用于治療。 1948年-大劑量維C用于治療炎癥。 1949年-維B3與維C用于治療精神分

3、裂癥。 1954年-自由基與人體老化的關(guān)系被揭開。 1957年-Q10多酶被發(fā)現(xiàn)。 1969年-體內(nèi)超級抗氧化酶被發(fā)現(xiàn)。 1970年-維C被用于治療感冒。 1993年-哈佛大學發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果。,本 章 基 本 要 求,一、掌握維生素類藥物的結(jié)構(gòu)特點與分析方法之間的關(guān)系。二、掌握維生素類藥物的鑒別原理與方法。三、掌握三點校正法測定維生素A的原理、測定方法與

4、計算方法四、掌握維生素D的HPLC含量測定法和維生素E的GC含量測定法五、掌握維生素B1非水溶液滴定法與維生素C碘量法的測定原理 方法與注意事項。六、熟悉本類藥物其他的含量測定方法七、熟悉本類藥物雜質(zhì)檢查方法八、了解維生素A三點校正法的推導過程,概 述,維生素： 是維持人體正常代謝機能所必需的微量活性營養(yǎng)物質(zhì)。 人體不能合成維生素。,VitA、D2、D3、 E、K1 等,脂溶性維生素:,水

5、溶性維生素:,VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、葉酸、煙酸、泛酸等,,分類,按溶解度可分為:,概 述,VitM,,尼克酸,,-H 維生素A醇-COCH3 維生素A醋酸酯-COC15H31 維生素A棕櫚酸酯,R :,第一節(jié) 維生素A,,,為一個具有共軛多烯側(cè)鏈的 環(huán)己烯,（一）,結(jié)構(gòu)與性質(zhì),一、,具有UV吸收,存在多種立體異

6、構(gòu)化合物,易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應,VitA2,VitA3,去氫維生素A,去水維生素A,,,鯨醇(維生素A醇的二聚體),,,△或有金屬離子存在時氧化↑,結(jié)構(gòu)與性質(zhì),一、,(三) 溶解性: 不溶于水,易溶于有機溶劑 和植物油等,環(huán)氧化物,VitA醛,VitA酸,條件: 無水無醇,CHCl3,藍色,紫紅,（BP（2000））,λmax為326nm一個吸收峰,λmax為348,367,389nm

7、三個吸收峰,,,去水VitA（VitA3）,↓,VitA,,,,,326nm,348nm,367nm,389nm,USP 顯色劑 磷鉬酸 規(guī)定斑點顏色和Rf值,BP 雜質(zhì)對照品法 顯色劑 : 三氯化銻,立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體,UV法,（一）,,維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸,三點校正法（法定方法）原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310

8、~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減??；（2）物質(zhì)對光的吸收具有加和性。,,2. 波長的選擇：（1） ?1 VitA的?max（328nm）（2） ?2 ?3 分別在?1的兩側(cè)各選一點,測定對象: VitA醋酸酯,??= 12nm,測定對象: VitA醇,?1=325nm, ?2=310nm, ?3=334nm,第一法：直接測定法

9、（1）基本步驟:第一步 測定吸光度，確定最大吸收波長,3. 測定法,注意： C 為混合樣品的濃度,第二步 求,第三步 求效價,換算因數(shù)由純品計算而得：,第四步：求標示量％,方法：,第一法,適應于純度高的維生素A醋酸酯,直接測定法,判斷 是否在326～329nm之間,在326～329nm之間,,,改用第二法,是,否,求算 并與規(guī)定值比較,,,規(guī)定值 差值,判斷差值

10、是否超過規(guī)定值的,有一個以上超過,無超過,,,計算 A328（校正）,用A328計算,,,,,第二法,第二法,,f值,討 論,VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導而來；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導而來。在應用三點校正法時，除其中一點在最大吸收波長處測定外，其余兩點均在最大吸收峰的兩側(cè)進行測定。在測定前務必要校正波長。測定的樣品應不得少于兩份。,VitAD膠丸中VitA的含量

11、測定 精密稱取本品裝量差異項下的內(nèi)容物 0.1287g (規(guī)格10000VitAIU/丸,平均裝量0.07985g/丸)至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為,A300 ：0.374A316 ：0.592A328

12、 ：0.663A340 ：0.553A360 ：0.228,A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344,求本品中維生素A占標示量的百分含量？,A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：

13、0.834A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01－0.01 0 + 0.02 + 0.04,－－－－－,=====,A328(校正) = 3.52 ( 2A328 - A316 - A340 ) =3.52 ( 2×0.663 – 0.592 – 0.553 )

14、 =0.637,適用于維生素A醇,（等吸收比法）,第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法,[ 皂化法、6/7A法 ],（3）第二法,水溶性,脂溶性,,,并確定最大吸收波長（325nm),判斷?max是否在323~327nm之間,取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定,,,計算,是,否,判斷 A300 /A325 是否大于0.73,,,是,否,取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定,計算A325(校正),,,,,,0,3%,－3%,,,,HPLC法,

15、（二）,適合于維生素A醋酸酯原料和制劑中維生素A的含量測定。,高效液相色譜儀，紫外檢測,固定相：硅膠為填充劑流動相：正己烷：異丙醇=997:3檢測波長：325nm,三氯化銻比色法,（二）,優(yōu)點 : 簡便、快速,λmax 618nm～620nm,標準曲線法定含量,（三）,第二節(jié) 維生素B1的分析,維生素B1廣泛存在于米糠、麥麩和酵母中，還可以人工合成。 具有維持糖代謝及神經(jīng)傳導與消化的正常功能，主要用于治療腳氣病

16、，多發(fā)性神經(jīng)炎和胃腸道疾病。,氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿),第二節(jié) 維生素B1的分析,HCl,,Cl-,,鹽酸硫胺,（一）,溶解性,1、易溶于水,2、水溶液呈酸性,（二）,UV,共軛雙鍵,λmax = 246nmE1%1cm=406~436,與生物堿↓→↓(K2HgI4,硅鎢酸等）,（三）,硫色素反應,（四）,（五）鹽酸根 呈氯化物的反應，用于鑒別。,鐵氰化鉀,ChP,鑒別試驗,二、,-2H,,

17、,,硫色素,,,＋2H,,,VitB1,H+,H+,H+,H+,,,,,S元素反應,Cl-反應,,(,),2,1,PbS,NaS,VitB,NO3,Pb,NaOH,,,以電位法指示終點,反應摩爾比為1：2,UV法,（二）,片劑、注射劑,= 421,（每片）相當于標示量的%=,A = ECL,g/100ml,ChP,（每ml）相當于標示量的%=,規(guī)格g/ml,ml,,,,,,%,V,E,A,%,cm,100,1,100,1,1,

18、5;,標示量,稀釋倍數(shù),×,×,原理,1、,熒光,硫色素,異丁醇,鐵氰化鉀,1,VitB,NaOH,,,或正丁醇,（1）靈敏度高，線性范圍寬;（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用 于體液分析.,第三節(jié) 維生素C的分析,維生素C又稱L-抗壞血酸，在化學結(jié)構(gòu)上跟糖類物質(zhì)十分相似，有四種光學異構(gòu)體，其中以L-構(gòu)型右旋體生物活性最強。 常見的有：泡騰片，泡騰顆粒等。,第三節(jié) 維生素C的分析,

19、L－抗壞血酸,*,*,結(jié)構(gòu)特點：,烯二醇,內(nèi)酯環(huán),手性碳,2、水溶液呈酸性,,C3－OH的pKa = 4.17,C2－OH的pKa = 11.57,,,一元酸,L(+)－抗壞血酸活性最強,手性C（C4、C5）,*,*,二烯醇結(jié)構(gòu),二酮基結(jié)構(gòu),二烯醇結(jié)構(gòu),有活性,有活性,無活性,二酮古洛糖酸,去氫抗壞血酸,與堿反應,酮酸鹽,糖類的顯色反應,50℃,結(jié)構(gòu)與糖類相似,△,（七）紫外吸收特性,具有共軛雙鍵，其稀鹽酸溶液在243nm處有最

20、大吸收波長。百分吸收系數(shù)為560.在中性或堿性條件，吸收紅移，265nm處。,1、與AgNO3反應,2、與2，6 - 二氯靛酚反應,(ChP2010),氧化型,,,玫瑰紅色,,,(ChP2010),（玫瑰色）,（無色）,,3.其他氧化劑的反應：亞甲藍或高錳酸鉀 試劑褪色堿性酒石酸銅 磚紅色沉淀磷鉬酸 鉬藍,,,,4. 薄層色譜法,薄層板：GF254,展開劑：乙酸乙酯-乙醇-水=5:

21、4:1,紫外燈：254nm,或鹽酸,50℃,吡咯,USP,,（藍色）,(糠醛),（戊糖）,,50℃,(吡咯),BP2010,0.01mol/L HCl,三、雜質(zhì)檢查,1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì) 分光光度法2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法 3. 草酸的檢查：與鈣離子反應是否生成沉淀,,指示劑: 淀粉指示液,,H+,取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100m

22、l與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液顯藍色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當于8.806mg的C6H8O6,,,,,（1）酸性環(huán)境 d . HCl,（2）新沸冷H2O,減慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定,趕走水中O2,減少O2的干擾,（4）附加劑干擾的排除,片劑 —— 滑石粉 —— 過濾,注射劑 —— 抗氧劑 ——,丙酮甲醛

23、,,,,,,,,,,,USP32,JP15,酚亞胺,二氯靛酚,VitC,,無色,,（2）快速滴定 2min內(nèi),（1）酸性環(huán)境 HPO3-HAc,穩(wěn)定VitC,防止其他還原性物質(zhì)干擾,（3）剩余比色測定,（定量過量）,（測剩余染料）,,,（4）缺點,需經(jīng)常標定,貯存≤一周,不穩(wěn)定,,干擾多 氧化力較強,（三）HPLC法,色譜柱：C18 ODS（4.6mm×20cm,5um)流動相：甲醇-5%偏磷酸=2.5:97.5流速

24、：1ml/min檢查波長：245nm柱溫：25 0C,分析條件：,第四節(jié) 維生素D的分析,維生素D2,一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì),一類抗佝僂病維生素的總稱,維生素D3,1,2,5,4,3,6,7,8,9,10,12,11,19,13,14,15,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27,二、性質(zhì),1、性狀：無色針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末，易變質(zhì),2、溶解性：水中不溶，易溶有機溶劑（CHCl3等）,3、不穩(wěn)定性：含烯鍵，易被

25、氧化,4、旋光性：具有手性碳,5、顯色反應： CHCl3中加醋酐與硫酸顯黃色，逐漸 變紅色，再迅速變紫色，最后變綠色,6、紫外吸收特性：最大吸收265nm,D2吸收系數(shù)460~490，D3:465~495,,開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應，可用于鑒別。,,,手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。,多烯：可進行紫外檢測。,二、鑒別試驗,1. 顯色反應,三氯化銻反應

26、橙紅色漸變粉紅,三氯化鐵反應 橙黃色,二氯丙醇和乙酰氯反應 綠色,,可用于鑒別，但專屬性不強,2. 比旋度鑒別,維生素D2,維生素D3,溶 劑,濃 度,比旋度值,無水乙醇,無水乙醇,40mg/ml,5mg/ml,+102.5°～+107.5°,+105°～+112°,注意事項：應于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣， 在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定。

27、,以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸，D2顯紅色，在570nm處有最大吸收，D3顯黃色，在495nm處有最大吸收。,3.其他方法： TLC、HPLC、制備衍生物測熔點,4.區(qū)別反應：,三、雜質(zhì)檢查,四、含量測定方法,第五節(jié) 維生素E的分析,維生素E為α-生育酚及其各種酯類，有天然品和合成品之分。天然品為右旋體，合成品為消旋體。,苯并－二氫吡喃醇,第五節(jié) 維生素E的分析,,*,*,*,1,2,3,4,5,6,7,8,

28、1，,3，,5，,7，,9，,11，,13，,dl－α－生育酚醋酸酯,苯環(huán) + 二氫吡喃環(huán) + 飽和烴鏈,1、UV 最大吸收波長284nm,2、乙?；姆恿u基 易水解,醌型化合物,,△,生育酚,-,+,or OH,H,VitE,,雜質(zhì)，需檢查,3. 溶解性：維生素E為黃色粘稠液體，易溶于有機 溶劑，不溶于水,4. 氧化性：維生素E對熱穩(wěn)定，但易被氧化生成醌

29、 形產(chǎn)物或聚合,生育紅,,（一）,硝酸反應,橙紅色,（橙紅色）,生育紅,生育酚,,HNO3,,生育酚,對-生育醌,,[O],,血紅色,= 41.0～45.5,λmax = 284nm,λmin = 254nm,0.01%無水乙醇中,UV法,（三）,薄層板 硅膠G,展開劑 環(huán)己烷 -乙醚（4 ：1）,顯色劑 硫酸（105℃ 5′）,?-生育酚 醋酸酯Rf =

30、0.7?-生育酚 Rf = 0.5?-生育醌 Rf = 0.9,TLC法,（四）,2. 游離生育酚,雜質(zhì)檢查,三、,原理:,,酸度 以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積控制。,（M生育酚= 430.8）,例,取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過 1.0ml。,≤2.15％,限量,GC法（

31、法定方法）,（一）,選擇性好靈敏度高速度快分離效能好,揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強→衍生化易受樣品蒸氣壓限制,載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）二甲基聚硅氧烷柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2,內(nèi)標法加校正因子,內(nèi)標法:,供試液（樣品+內(nèi)標）,內(nèi)標物,對照液（對照+內(nèi)標）,是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近,,校正因子：,

32、f=(As×mi)/(Ai×ms),Wi%=(Ai×fi×ms)/(As×fs×w) ×100%,ms：內(nèi)標物的質(zhì)量mi: 被測物的質(zhì)量Ai: 被測物的峰面積As:內(nèi)標物的峰面積Wi: 被測物組分的百分含量W：混合樣品的質(zhì)量,（二）HPLC法 外標法 此外，還有鈰量法、比色法和熒光法,,練習與思考,[A型題],1. 維生

33、素B1的鑒別方法是A.三氯化鐵反應 B. 硫色素反應 C.與堿性酒石酸銅試液反應 D. 雙縮脲反應,,2. 維生素E《中國藥典》規(guī)定的含量 測定方法為A.非水溶液滴定法 B.旋光法 C.HPLC法 D.紫外分光法 E.GC法,[B型題],A.亞硝基鐵氰化鈉反應 B. 硫色素反應 C.硝酸反應 D. 三氯

34、化銻反應 E. 硝酸銀試液的反應 F.醋酐-濃硫酸 1. 維生素C 2. 維生素E 3. 維生素B1 4. 維生素A 5. 維生素D,E,C,B,D,F,D,[X型題],1. 用碘量法測定的藥物有A. 醋酸地塞米松 B. 丙酸睪酮 C. 維生素C D. 硫酸阿托品 E. 維生素C注射液,,,本章