白淺灰鏈霉菌對聚乙烯降解效果研究及降解酶的基因克隆.pdf

1、近幾年工業(yè)的迅速發(fā)展帶來了嚴(yán)重的“白色污染”問題，影響著我們的生產(chǎn)與生活，在眾多緩解“白色污染”、處理廢棄塑料的方法中，利用微生物降解塑料成為熱門研究領(lǐng)域之一。
　　本試驗首先從土壤中篩選、分離出一株能夠降解聚乙烯的放線菌，通過進(jìn)行菌落形狀、大小、顏色等形態(tài)學(xué)的觀察、生理生化鑒定和16S rDNA的全序列克隆測序，鑒定其為Streptomyces albogriseolus白淺灰鏈霉菌。
　　其次初探白淺灰鏈霉菌對聚乙烯的降

2、解效果研究:(1)對相對分子量分別為2000、5000、10W和40W的聚乙烯粉末進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同分子量的聚乙烯粉末都可以被白淺灰鏈霉菌降解，且降解程度從大到小依次為:2000＞5000＞10W＞40W;(2)對相對分子質(zhì)量＞100W的聚乙烯膜片進(jìn)行研究，結(jié)果表明白淺灰鏈霉菌附著在聚乙烯膜片上進(jìn)行生長且在肉眼和掃描電子顯微鏡下觀察均發(fā)現(xiàn)膜片表面有破損和孔洞，由此說明聚乙烯膜片也可以被白淺灰鏈霉菌所降解。所以可知白淺灰鏈霉菌不僅屬于

3、低分子量聚乙烯降解菌，也屬于高分子量甚至超高分子量降解菌。
　　再次探究白淺灰鏈霉菌降解聚乙烯的關(guān)鍵酶:先用漆酶和HBT（1-羥基苯并三唑）構(gòu)建了一個中間體或介導(dǎo)體，在30℃的環(huán)境中降解相對分子質(zhì)量為2000的聚乙烯粉末，在3d以后可以看到實驗組的聚乙烯粉末顆粒變小，溶液呈淺黃色。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)和實驗結(jié)果表明漆酶是降解聚乙烯的關(guān)鍵酶。利用ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）法檢測白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中含有

4、漆酶蛋白且測定其酶活。比較NCBI gene數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的鏈霉菌漆酶基因序列，設(shè)計引物K-F2、K-R2，利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增出白淺灰鏈霉菌基因組DNA中的漆酶基因，進(jìn)行BLAST比對與分析。將得到的漆酶基因與克隆質(zhì)粒pEASY-T1 Cloning Vector連接，構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pEASY-T1 Cloning Vector/laccase，導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 Phage ResistantChemicall

5、y Competent Cell中并進(jìn)行陽性克隆驗證。采用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ對重組克隆質(zhì)粒pEASY-T1 Cloning Vector/laccase與原核表達(dá)載體pET-32a-c(+)Vector進(jìn)行雙酶切，露出粘性末端，采用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞中BL21(DE3) Chemically Competent Cell中并進(jìn)行陽性克隆驗證。
　　最后，將攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌

6、BL21(DE3)進(jìn)行檢測:(1)將其接種在聚乙烯為唯一碳源和能源的基礎(chǔ)無碳源固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生長，結(jié)果顯示有菌落長出，說明大腸桿菌BL21(DE3)可以利用聚乙烯粉末;(2)將攜帶pET-32a-c(+) Vector/laccase的大腸桿菌BL21(DE3)的發(fā)酵液用硫酸銨分級沉淀制成粗酶液，用SDS-PAGE檢測到粗酶液中含有漆酶蛋白且分子量大小約為66.4 KDa。
　　通過一系列的基因克隆技術(shù)，將白淺灰鏈霉菌中的漆酶基