胞外ATP作用人成熟精子的機(jī)制研究.pdf

1、分類號：密級：公開UDC：學(xué)號：407324314053南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文胞外胞外ATP作用人成熟精子的機(jī)制研究作用人成熟精子的機(jī)制研究StudyingthemechanismofextracellularATPactionsonhumanmaturesperm鄒乾興培養(yǎng)單位（院、系）：生命科學(xué)學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：曾旭輝教授申請學(xué)位的學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：神經(jīng)生物學(xué)論文答辯日期：2017年5月28日答辯委員會主席：陳斌

2、評閱人：陳斌周文良年月日摘要I摘要人成熟精子進(jìn)入女性生殖道后，需經(jīng)歷一系列生理生化變化過程包括獲能、超活化運動和頂體反應(yīng)等，最終才能與卵細(xì)胞完成受精。精子這些生理過程受到女性生殖道內(nèi)多種生理因子的調(diào)控。其中，胞外ATP（ATPe）作為一種重要的生理調(diào)節(jié)因子被報道存在于女性生殖道中，并且體外研究表明其對人成熟精子超活化運動、頂體反應(yīng)和受精能力均具有顯著促進(jìn)作用。然而，ATPe作用人成熟精子生理功能的具體機(jī)制目前尚未闡明?；诎麅?nèi)Ca2信號

3、在成熟精子功能調(diào)控中的核心作用，因此我們首先利用多功能酶標(biāo)儀檢測ATPe對人精子胞內(nèi)Ca2濃度（[Ca2]i）的影響。結(jié)果顯示ATPe（0.050.10.20.512.55mM）濃度依賴的增加[Ca2]i，并且在2.5mM時達(dá)到飽和。通過利用BAPTA將精子胞外溶液中Ca2螯合之后，發(fā)現(xiàn)ATPe不再引起精子[Ca2]i增加，表明ATPe增加的[Ca2]i來自于外Ca2內(nèi)流。ATPe的效應(yīng)主要由細(xì)胞膜上的P2受體介導(dǎo)。我們選擇兩種廣譜的P

4、2受體抑制劑PPADs和suramin，發(fā)現(xiàn)它們能顯著抑制ATPe誘導(dǎo)的人精子[Ca2]i增加。為驗證具體是哪種P2受體介導(dǎo)ATPe對人精子的效應(yīng)，westernblot揭示多種P2受體包括P2X（2347）和P2Y（12）在人成熟精子中有表達(dá)。由于小鼠精子中的ATPe效應(yīng)被認(rèn)為是由P2X2受體通道介導(dǎo)，但我們利用膜片鉗技術(shù)在人精子中并未檢測到ATPe激活的P2X2電流。另外，抗體阻斷實驗結(jié)果顯示在P2X（2347）和P2Y（12）這些

5、抗體中，只有P2Y1抗體顯著抑制ATPe增加的[Ca2]i，表明ATPe對人精子的效應(yīng)通過作用于P2Y1受體。由于P2Y1是一種G蛋白偶聯(lián)受體，而ATPe誘導(dǎo)的人精子[Ca2]i來自于外Ca2內(nèi)流，因此我們猜想受ATPe激活后的P2Y1可能作用于細(xì)胞膜上的Ca2通道。精子特異的CatSper通道，因其在調(diào)控胞內(nèi)Ca2信號以及精子功能中的重要作用，而成為最可能的候選Ca2通道。確實，我們發(fā)現(xiàn)ATPe能增加CatSper電流，并且CatSp

6、er抑制劑mibefradil和AR720均顯著抑制ATPe增加的[Ca2]i和CatSper電流，說明CatSper介導(dǎo)了ATPe誘導(dǎo)的人精子外Ca2內(nèi)流。此外，ATPe增加的CatSper電流能被P2Y1抗體抑制；并且P2Y1和CatSper在人精子中有相似的定位，均定位在精子尾部；以及在精子胞內(nèi)增加GTP濃度可以加強(qiáng)ATPe對CatSper電流的增加效應(yīng)；表明ATPe激活CatSper是一種由P2Y1受體介導(dǎo)的間接作用。我們進(jìn)一步