激光共聚焦顯微鏡原理和操作

1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),樣品要求原理 功能 在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm,二、 原理,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),原理小結(jié):

2、Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描

3、，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取

4、連續(xù)光學(xué)切片,conventional,confocal,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4. 由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明2.具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦), 共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)

5、所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)—— 逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61?/NA （0.25 ?m ) Confocal: Rxy=0.4?/NA（0.18 ?m )2. 樣品的最大厚度: 取決于:

6、物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動(dòng)范圍(166?m、Z-wide)3. 樣品的最小光切厚度: (載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm） 取決于: 物鏡的NA、針孔大小 Z軸的最小移動(dòng)步距: 40nm Z軸的分辨率: 0.35 ?m,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),4. 激光器

7、 Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特點(diǎn): 1) 方向性好: 激光基本延直線(xiàn)傳播 2) 單色性好 :??=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合,激光掃描共焦顯微鏡

8、技術(shù),5. 四個(gè)熒光通道, 一個(gè)透射光通道 即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光圖像為非共焦圖像。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),6.掃描速度: slow 220lines/s 512?512 2-3秒 slow2 440lines/s（2：雙向掃描）

9、 medium 450lines/s 512?512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512?512 0.7秒

10、 128?128 0.2秒 fast2 2000lines/s7. 掃描密度: 64?64 128?128 512?512 1024?1024 2048?2048,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用,The application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,功能.1

11、.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無(wú)損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時(shí)間序列掃描: xyt 、xyzt 和 xt 掃描8.圖像處理9. 旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,應(yīng)用定位、定量三維重組動(dòng)態(tài)測(cè)量 ? 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的

12、變化 測(cè)量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) ?自由基的檢測(cè) ?藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程、定位分布及定量 ?蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（ pH值）的測(cè)量線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)量熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量籠鎖解籠鎖的測(cè)量熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測(cè)量其他應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,一、定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三

13、標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交-fitc + PI熒光原位雜交： 染色體基因定位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,定位、定量研究中

14、常用熒光探針1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/5

15、72 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白)

16、 Texas Red 595/615 (德州紅) Cy3 558/568BODI

17、PY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,1)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián), 直標(biāo): 一抗+熒光探針 間標(biāo): 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗體+熒光探針

18、) 肌動(dòng)蛋白actin ( Palloidine+熒光探針)2)細(xì)胞膜表面受體配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2) 標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1)線(xiàn)粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染

19、活細(xì)胞，陽(yáng)離子, 可檢 測(cè)線(xiàn)粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時(shí)間短 JC1 線(xiàn)粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光 線(xiàn)粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線(xiàn)粒體，且為檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位最 佳探針Mitotracker Green FM 490

20、/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官

21、 為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較低

22、濃度標(biāo)記線(xiàn)粒體4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,?細(xì)胞器的單克隆抗體5)細(xì)胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細(xì)胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞Hochest 33342

23、 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO

24、500/526 DNA 活細(xì)胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞SYTO11~16 20~24 488/ 520 活細(xì)胞SYTO11~16 20~24 52

25、1/ 556 活細(xì)胞SYTO 17 621/634 活細(xì)胞,3. GFP 綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明

26、，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。 將外源基因與GFP DNA 相連, GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá).,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,GFP主要應(yīng)用: 對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過(guò)程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá), 如某種轉(zhuǎn)錄因子的核

27、轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動(dòng)態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過(guò)程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過(guò)程 可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)（FRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,三.動(dòng)態(tài)測(cè)量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量1).游離Ca2+測(cè)量

28、 檢測(cè)游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類(lèi)探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測(cè)Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的

29、10倍左右）,熒光探針 激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng) KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Gre

30、en-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-

31、1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,程序化測(cè)量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè) 量。 ?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對(duì)

32、測(cè)量1）單波長(zhǎng)公式法Fluo3: 530nm Kd=450nM[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無(wú)鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度( MnCl2)Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187)測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40）,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的

33、10倍左右）2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度3）比例熒光的測(cè)量.雙波長(zhǎng)(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯

34、微鏡應(yīng)用,快速Ca2+變化的測(cè)量1.改變掃描速度2.采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率）4.采用線(xiàn)掃描(xt),細(xì)胞器的Ca2+測(cè)量1.線(xiàn)粒體內(nèi)游離Ca2+測(cè)量 Fluo-3 + TMRM(線(xiàn)粒體熒光探針，紅色）2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化

35、 目前已商品化的探針可檢測(cè)：線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè),激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量的應(yīng)用鈣的特性1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫(kù)釋放稍有增加，導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開(kāi)關(guān)”細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4．卵子受精5．細(xì)胞分

36、裂和再生6．細(xì)胞調(diào)亡7．細(xì)胞間通訊,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,8．細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)9. DNA合成10. 基因表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病—胞內(nèi)鈣濃度異常2．糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內(nèi)鈣濃度增高3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)C

37、a2+濃度的10倍左右）,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,電刺激引起骨骼肌 細(xì)胞的Ca2+振蕩,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,pH值的檢測(cè)： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0,自由基的檢測(cè)熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm）2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外

38、H2DCF-DA 擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 酯酶脫乙酰DCF-H(不熒發(fā)光） DCF（發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm）H2rhod123 被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123（發(fā)光）,,,,,,,,,,,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,,,,,,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程及定位分布 xyzt 掃描,激光掃

39、描共焦顯微鏡應(yīng)用,四. 膜電位的測(cè)量標(biāo)記膜電位探針(慢反應(yīng)）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm

40、細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV線(xiàn)粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽(yáng)離子探針，更容易與線(xiàn)粒體親和，為線(xiàn)粒體膜電位探針,,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,七．熒光能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件：兩個(gè)熒光分子：供體-FL1

41、，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長(zhǎng)與受體的激發(fā)波長(zhǎng)一致,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,樣品要求：1.經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)）2.固定的或活的組織3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專(zhuān)用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上4.懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)：連續(xù)光譜型Confocal多光子激光掃描顯微鏡—— Multiph

42、oton Laser Scanning Microscopy,雙(多)光子激光掃描顯微鏡的優(yōu)勢(shì),,,多光子激光掃描顯微鏡簡(jiǎn)介,多光子激光器波長(zhǎng)從700-1000nm 連續(xù)可調(diào) 雙光子波長(zhǎng)：350-500nm 連續(xù) 三光子波長(zhǎng)：230-330nm 連續(xù) 應(yīng)用：可直接清晰活體觀察某些非標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)的分 泌 (5-HT) 或 NADPH的分布,例4 長(zhǎng)時(shí)間觀察活體阿爾茨海默病模型