1890型pcr熒光分析儀

1、1890型PCR熒光分析儀,介紹及應(yīng)用,實時熒光定量PCR的應(yīng)用,臨床方面的應(yīng)用 ? 疾病的臨床早期診斷 ? 建立病原體病分子診斷標(biāo)準(zhǔn) ? 療效考評 ? 指導(dǎo)制訂感染性疾病合理治療方案 ? 了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況 ? 醫(yī)院、血站及防疫站的確診 ? 新藥研究中藥物的作用效果? 研究Elisa方法的漏檢率 ? 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進行指導(dǎo),遺傳病診斷中的應(yīng)用? 等位基因檢測?

2、 多基因遺傳病的突變檢測 ? 基因表達異常所致遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的應(yīng)用? 腫瘤相關(guān)基因表達的檢測? 腫瘤標(biāo)志物（肽類激素和酶）? 腫瘤耐藥基因（MDR）,何謂PCR ?,聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)簡稱ＰＣＲ，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的ＤＮＡ片段的分子生物學(xué)技術(shù)。,試劑的定量原理：,Taqman水解探針定量Roche雜交探針定量分子信標(biāo)定量SYBR Green Ⅰ染料定

3、量,,,,雜交探針,分子信標(biāo),熒光能量共振轉(zhuǎn)移,,Taqman探針,,,,Taqman探針、雜交探針、分子信標(biāo)都是通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移直接或間接的產(chǎn)生特定波長的熒光，使儀器能檢測到,PCR的發(fā)展史,這項技術(shù)的發(fā)明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技術(shù) 公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段ＤＮ Ａ的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州１０１號高速公路上，靈機一動想到了一個實際上可以無限

4、擴增某段ＤＮＡ的簡單方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次學(xué)術(shù)會議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學(xué)家 中也引起了強烈的反應(yīng)。Ｃｅｔｕｓ給了Mullis一萬美元的獎金，隨后 把這項技術(shù)的專利以三億美元的價格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。在短 短的幾年內(nèi)，ＰＣＲ迅速成為分子生物學(xué)的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛 的實際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項技 術(shù)突破。１９９３年，Mullis因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。,PCR原理和

5、方法: (一),眾所周知，ＤＮＡ是由四種堿基按互補配對原則（即腺嘌呤Ａ對胸腺 嘧啶Ｔ，鳥嘌呤Ｇ對胞嘧啶Ｃ）組成的螺旋雙鏈。在細胞內(nèi)，ＤＮＡ復(fù)制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶--ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）結(jié)合到ＤＮＡ模板上，最 后，ＤＮＡ合成酶以這段引物為起點，合成與ＤＮＡ模板配對的新鏈。ＰＣＲ即是在體外模擬ＤＮＡ復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的ＤＮＡ片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引

6、物讓它們結(jié)合到ＤＮＡ模板的兩端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。 假定我們要研究的ＤＮＡ雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　在ＰＣＲ之前，我們首先人工合成兩段有２０－３０堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一

7、端配對，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別，以小 寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaacctat。 把這兩段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合 在一起，我們就可以開始做ＰＣＲ了。,PCR原理和方法: (二),第一步叫“變性”，把樣品加熱到９４－９６攝氏度一到數(shù)分鐘，讓 ＤＮＡ模板變性變成單鏈。　　第二步叫“退火”，讓樣品的溫度下降到５０－６５攝氏度一到數(shù)分鐘，引物

8、就可以結(jié)合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　　第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到７２攝氏度

9、一到數(shù)分鐘，ＤＮＡ聚合酶就可以從引物開始用底物復(fù)制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAA

10、AGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　　這樣經(jīng)過三步一個循環(huán)，一條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條……在一個由計算機控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個循環(huán)，就可以把原來的樣品精確地擴增了２的３０次方倍，而這只需要兩三個小時。,影響PCR特異性的因素,退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸

11、。 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7G

12、TP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。,擴增反應(yīng)可以無窮進行下去嗎？,答：不可以。因為經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進 入平坡，進入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達0.3～1pmol時，由于產(chǎn)物的

13、堆積，使原 來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有： ? 引物和dNTP等消耗完畢 ? Taq酶失活 ? 底物過剩 ? 非特異性擴增產(chǎn)物的競爭 ? 退火時產(chǎn)物的單鏈自己締合 ? 變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用?。ń沽姿峄?，雙鏈DNA）。,總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達到優(yōu)化，以取得優(yōu)良

14、的特異性和產(chǎn)率。,實時熒光定量PCR 的Ct值,,,,由圖我們也可以看出，在Ct值所在處重復(fù)性驚人的好。,Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。由于所設(shè)閾值都很低，所以Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性,,Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。,,,由圖可以看到當(dāng)擴增越靠后定量的重復(fù)性就越差。主要是因為①熒光定量技術(shù)要求在低濃

15、度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴增末期，擴增效率可能因為大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響。,,儀器的Ct值定量原理,固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。只要獲得未知樣品的Ct值，

16、即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),,縱坐標(biāo)代Ct值,利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,1890型PCR熒光分析儀的特點,高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)采用長壽命的LED激發(fā)光源可對PCR擴增全過程進行實時動態(tài)監(jiān)測無需開啟PCR反應(yīng)管，可避免在PCR期間及PCR之后產(chǎn)物污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確,可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在單一反應(yīng)中取得更多信息全中文界面，靈活的程序設(shè)定、全面的分析和報告

17、功能，全部參數(shù)可儲存可打印多個或單個樣本報告,儀器主要技術(shù)規(guī)格,樣本數(shù)： 32 反應(yīng)管（光學(xué)玻璃管）長： 35mm 容積（反應(yīng)體積） 10-20ul 溫度范圍： 40℃-98℃ 溫度控制： 1℃/S-10℃/S 激發(fā)光波長： 47

18、0nm（LED） 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸入電源/功率： AC220V 50HZ/800VA,儀器工作原理 （一）,,儀器工作原理 （二）,圖一蓋中的加熱器在計算機控制下向熱室中交,替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風(fēng)扇電機,攪勻，由于空氣無

19、有效質(zhì)量，熱室可以迅速達到,設(shè)置溫度，由此進行PCR的溫度循環(huán)。32個樣品,在周向馬達的帶動下逐一經(jīng)過信號采集的光學(xué)系,統(tǒng)，為采樣的準(zhǔn)確定位光學(xué)結(jié)構(gòu)由絲桿馬達進行,微調(diào)。由長壽命的LED光源(470nm)激發(fā)毛細,管中的熒光，該熒光通過一組復(fù)合濾鏡和透鏡分,別同時到3個接收器上(520nm,640nm,710nm),完成了儀器的實時采樣。,強大的軟件功能,參數(shù)設(shè)置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、 升降溫速率、檢測通道選擇）樣

20、本資料記錄功能文件運行顯示功能（PCR熱循環(huán)數(shù)據(jù)顯示、熒 　　光檢測數(shù)據(jù)顯示）檢測數(shù)據(jù)分析功能分析結(jié)果輸出功能故障保護和報警功能,先進的光路系統(tǒng),選用長壽命LED激發(fā),無需預(yù)熱，無需校正采用了先進的非球面鏡設(shè)計，提升了儀器的光學(xué)性能，縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質(zhì)的濾光片，硬膜鍍膜技術(shù)，窄帶低背景高透過率不霉變實時三色熒光檢測，盡善盡美,傳統(tǒng)96孔板和離心毛細管比較,毛細管 96

21、孔板?標(biāo)本量小，耗材成本稍高 ? 標(biāo)本量大，耗材成本低?由于離心，每個樣品孔間溫度 ?由于加熱模塊的邊緣效應(yīng)，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差異?加熱介質(zhì)空氣與反應(yīng)體系無縫 ? 96孔板反應(yīng)面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故升降

22、 速度慢 溫速度快 ?一個40個循環(huán)的實驗只需30-45 ?一個40個循環(huán)的實驗需要2小時 分鐘 ?光源與檢測器對每個樣品來說 ?每個樣品孔距離光源和檢測器 是等距離的，減少了系統(tǒng)誤 光程不同，可能對結(jié)果產(chǎn)生 差 影響,,,

23、由于定量PCR必須借助于樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)的樣品架很好地解決了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品之間條件的一致性，避免了微小差別被指數(shù)級發(fā)大。,,,優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學(xué)范圍,儀器能在7個數(shù)量級的范圍內(nèi)得到非常好的線性結(jié)果。相關(guān)系數(shù)（r）可達3個9。且有優(yōu)異的靈敏度和極佳的重復(fù)性,友好方便的操作界面,方便的樣品編輯界面,,方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面,,一目了然的運行界面,,● 時實反應(yīng)了當(dāng)前樣