基層培訓-血液檢驗

1、第一章 血液檢查 掌握要點：1、抗凝劑的應(yīng)用選擇2、血涂片的制備和瑞氏染色3、外周血白細胞分類和常見異常細胞的辨認（重點）4、三分類血球計數(shù)儀的工作原理和主要參數(shù)（重點）5、血細胞直方圖的特點、分析和臨床應(yīng)用（重點）6、血細胞計數(shù)儀使用的注意事項（重點）7、血細胞檢測的主要臨床意義,第一節(jié) 血液一般常規(guī)檢查 一、標本采集及抗凝劑應(yīng)用血液標本的采集可分為毛細血管采血法和靜脈采血法。需血量較少的項目和檢測方法可以用毛

2、細血管采血法。自動血細胞分析儀需血量較多，提倡用靜脈采用法。毛細血管和靜脈之間，無論細胞成分和化學組成都存在一定程度的差異，在分析和比較結(jié)果時應(yīng)予以考慮。需要作準確的測定時必須用靜脈采血方法。,EDTA二鉀是血液常規(guī)檢查最常用的抗凝劑，常用量為1.5～2.2mg/ml血液，此抗凝劑不影響白細胞的數(shù)量和大小，對于紅細胞影響也很小，且可以抑制血小板聚集，故用于血細胞計數(shù)和形態(tài)分析。但它不適用于作凝血因子和血小板功能試驗。需要注意的是有個別病

3、人的血小板對EDTA抗凝劑有抵抗作用，可以造成部分血小板聚集，引起血小板計數(shù)假性減低，這種病人的標本需要用枸櫞酸鈉作為抗凝劑才能得到準確的血小板計數(shù)結(jié)果。,根據(jù)ICSH1993年文件建議：血細胞計數(shù)同EDTA-K2作抗凝劑，用量為EDTA-K2-2H2O 1.5-2.2mg/ml血液。但是EDTA影響血小板聚集，不適合于作凝血象檢查和血小板功能試驗。,枸櫞酸鈉：對凝血V因子有較好的保護作用，故常用于凝血功能檢查。紅細胞沉降率測定也采用此

4、抗凝劑，但與前者采用不同的濃度。取血一定嚴格按照比例進行，取血后要上下顛倒試管8次，以使抗凝劑與血液充分混合，達到抗凝目的。,肝素：因其有使血小板趨向聚集的作用，不適用于血細胞的常規(guī)檢查。由于肝素可引起白細胞聚集，并使血涂片在羅氏染色時產(chǎn)生藍色背景，所以肝素抗凝血不適合血液學一般檢查。肝素抗凝主要用于血氣分析、紅細胞脆性試驗、血液流變學檢查及生化檢查。,表1 不同顏色帽的真空采血管應(yīng)用范圍--------------------

5、----------------------------------------------------------------顏色 抗凝劑 應(yīng)用范圍------------------------------------------------------------------------------------ 灰 草酸鹽，氟化鈉 全

6、血、血漿，抑制糖原分解的酶 黃 分離膠 血清，主要用于生化和免疫學檢查 綠 肝素 全血、血漿，主要用于血氣分析 紅 不含分離膠 血清，主要用于生化和免疫學檢查 藍 拘櫞酸鈉 血漿，主要用于凝血纖溶和血小板聚集試驗

7、 紫 乙二胺四乙酸鹽 全血、血漿，主要用于血細胞檢查------------------------------------------------------------------------------------,二、目測計數(shù)法 （一）原理 將采集的血液標本加入一定量的稀釋液中，（如計數(shù)白細胞，還應(yīng)加入一定量的溶血劑，將紅細胞破壞。以便計數(shù)白細胞；如計數(shù)血小板可加入溶血劑破壞紅細胞，也可不加入溶血劑

8、，直接計數(shù)）滴入計數(shù)盤，按一定操作規(guī)則計數(shù)上述三種不同的血細胞，然后再按一定的計算公式計算出每升血液中的細胞數(shù)量,（二）試劑，包括： 紅細胞稀釋液（Hayem液），甲醛拘櫞酸鹽稀釋液和生理鹽水），白細胞稀釋液（主要成分是冰醋酸），血小板稀釋液（草酸銨溶液和復方尿素液，均為溶血法，直接計數(shù)）。如何配制可參看操作規(guī)程手冊。,（三）器材，主要有 一次性采血針，一次性微量（10?l和20?l）毛細采血管，血細胞計數(shù)盤和普

9、通光學顯微鏡。,（四）操作，要點如下： 1、正確選擇采血部位 2、消毒 3、穿刺（一針見血） 4、第一血棄去 5、毛細管采血（沒有氣泡，不能凝集） 6、稀釋、加樣、計數(shù),（五）計數(shù)誤差 血細胞的計數(shù)誤差可分為技術(shù)誤差和固有誤差。 1、技術(shù)誤差 由于操作不正規(guī)和儀器不精確造成的誤差稱為技術(shù)誤差。這類誤差通過主觀努力，即可避免或逐漸縮小。常見技術(shù)誤差如下：,（1）取血部位不當。局部凍瘡、水腫、紫紺、發(fā)

10、炎均可影響結(jié)果，使標本失去代表性。（2）稀釋倍數(shù)不準。如吸血不準、未擦去管外余血、吸取稀釋液不準、稀釋液因蒸發(fā)而濃縮等。,（3） 血液凝固。如取血時動作緩慢或用力擠壓混入大量組織液，以及吸血管內(nèi)有殘留酒精，促使血液凝固。（4）充液不當。充液過多，稀釋血液外逸；斷續(xù)充液，計數(shù)室內(nèi)產(chǎn)生氣泡；或充液后蓋片移動，均可使細胞分布不均，還可影響計數(shù)室容積，使計數(shù)結(jié)果偏低或偏高。,（5） 稀釋血液混合不均，紅細胞在計數(shù)室內(nèi)分布相差懸殊，

11、超過下述固有誤差范圍。（6）白細胞影響。在紅細胞稀釋液中，白細胞和紅細胞同時存在，通常在計數(shù)時把白細胞也數(shù)在內(nèi)。只是在一般情況下白細胞較少，僅相當于紅細胞1/500-1/1000，實際影響很小，可以忽略不計。,但白細胞過高患者，作紅細胞計數(shù)時，則應(yīng)將白細胞扣除。例如某病人“紅細胞計數(shù)”為1.8?1012/L，白細胞計數(shù)為200?109/L，則病人實際紅細胞應(yīng)為1.6?1012/L。或者在高倍鏡下注意識別，勿將白細胞計入。白細胞體積常

12、較大，中央無凹陷，細胞核隱約可見，無黃綠色折光。,（7）血漿自家凝集素或球蛋白過高，可使紅細胞凝集或形成緡線狀，影響計數(shù)。必要時可改用31.3g/L枸櫞酸鈉液重新計數(shù)。,（8）儀器誤差。微量吸管須用水銀稱重法檢查矯正，誤差應(yīng)小于?1%。計數(shù)室深度可用千分卡尺法測定，誤差應(yīng)小于?2%。計數(shù)室面積可用測微計測定，每大格邊長誤差應(yīng)小于?1%。蓋玻片應(yīng)為專用血細胞計數(shù)盤蓋片（24?20?0.6mm），要求平整光滑，高倍鏡檢無裂隙。兩面光學誤差應(yīng)

13、小于?0.002mm。,2、固有誤差 即使計數(shù)熟練者，使用同一儀器，用同一稀釋血液多次充液計數(shù)，結(jié)果也常有一定差異。這種由于在計數(shù)室內(nèi)，每次血細胞分布不可能完全相同所造成的誤差，稱為固有誤差或計數(shù)域誤差。,根據(jù)統(tǒng)計學研究，血細胞在計數(shù)室內(nèi)的隨機分布符合泊森分布，其計數(shù)誤差隨計數(shù)量越大而減小。例如計數(shù)500個紅細胞，其變異系數(shù)CV為4.5%，而計數(shù)1000個紅細胞，其CV為3.16%。,（六）質(zhì)量保證 1、采血時應(yīng)做到“一針見

14、血”，血液流出要順當，第1滴血因常含有組織液而應(yīng)棄去，然后再用微量毛細管吸取血液標本。血流不暢時，不能用手擠壓，以免混入組織液和破壞血細胞形態(tài)。血液在毛細吸管中停留時間不易過長，一以免發(fā)生凝集。加入稀釋液后要反復沖洗和混勻，以保證血細胞分布均勻。,2、滴入計數(shù)盤時不能有氣泡，以免影響計數(shù)。計數(shù)時要按一定規(guī)則進行，不要重復計數(shù)和漏數(shù)。3、加蓋玻片方式應(yīng)采用WHO推薦的“推式”法，這種方法比直接“蓋式”更能保證液體體積高度為0.10mm。

15、,4、稀釋液要過濾，各種試管、吸管和計數(shù)板均應(yīng)清潔，避免雜質(zhì)、微粒等污染，計數(shù)時被誤認為是血細胞。,（七）質(zhì)量考核 關(guān)于目測計數(shù)法，至今尚無公認而且成熟的質(zhì)量控制方法。關(guān)鍵在于嚴格遵守操作規(guī)程，掌握其誤差規(guī)律，平時熟練操作技術(shù)?，F(xiàn)介紹以下幾種。,1、經(jīng)驗控制 主要根據(jù)白細胞計數(shù)結(jié)果與白細胞分布密度是否相符（表1）。由于血膜厚薄難以控制，因此只能作為結(jié)果的粗略估計，有矛盾者應(yīng)復查。,表1 血膜上WBC密度與WBC量的關(guān)系---

16、------------------------------------------------------ 血膜上白細胞 /高倍鏡 WBC計數(shù)--------------------------------------------------------- 2-4 (4-7)?109/L

17、 4-6 (7-9) ?109/L 6-10 (7-9) ?109/L 10-12 (13-18) ?109/L-------------------------------------------------

18、-------,2、常規(guī)考核標準（RCS） 本法根據(jù)白細胞在計數(shù)室內(nèi)四大格的分布情況而規(guī)定的。如果超過下述標準者，應(yīng)該重新混勻懸液，滴入另一計數(shù)盤中進行計算，直至符合下述標準才能報告。,四大格所見白細胞最大值-最小值RCS=---------------------------------------------- ?100% 四大格所見白細胞數(shù)平均值評價： WBC小于4?109/L者，

19、RCS應(yīng)小于 30%； WBC在(4.1-14.9) ?109/L之間者，RCS應(yīng)小于20%; WBC大于15?109/L者，RCS應(yīng)小于15%。 以上兩種方法可作為自我質(zhì)量控制使用。,3、兩差比值評價法所謂"兩差"比值即同一標本或同一病人在短時間內(nèi)兩次計數(shù)細胞數(shù)之差和兩次細胞技術(shù)的標準差之比。,X1 – X2 兩差比值= ---------------

20、 X1 + X2 X1、X2分別為第一、二次鏡下數(shù)的細胞數(shù)。,質(zhì)量得分=100-（兩差比值?20.1） 注：根據(jù)統(tǒng)計學理論兩差比值大于1.99，則兩次結(jié)果有顯著性差異。故失分系數(shù)為40/1.99=20.1,評價： 90-100分為A級（優(yōu)）, 80-89分為B級（良）, 70-79分為C級（中）,

21、 60-69分為D級（及格）, 小于60分為E級（不及格）。 本法適用于人數(shù)較多（如30人以上）的技術(shù)考核，或市、區(qū)集體考核。,三、血細胞涂片和染色（一）涂片涂片時，血滴越大、角度越大、推片速度越快，則血膜越厚。反之則越薄。推片不光滑，血膜成毛刷狀；推片用力不均勻，血膜呈斷續(xù)的搓板狀；載玻片不清潔，血膜中則有氣泡；血量過多，血膜無尾。一張良好血涂片的標準是：薄厚適宜，頭體尾

22、分明，細胞分布均勻血膜邊緣整齊，兩邊和兩端留有空隙各0.3cm和0.5cm, 血膜長度占載玻片的2/3左右。,方法：取新鮮血液一滴，置載玻片的一端。左手持載玻片，右手將邊緣平滑的推片的一端從血滴前方后移接觸血滴，血滴即沿推片散開。使推片與載玻片夾角保持在30～45度，平穩(wěn)地向前移動推片，載玻片上便留下一薄層血膜。血膜干燥后，立即固定染色。注意要將病人姓名或編號寫在載玻片上，以便識別。,圖1 外周血涂片方法和適宜觀察處,圖2 血

23、涂片的正確方法,良好血涂片“標準”為血膜由厚到薄之間逐漸過度；血膜的體尾交界部位，紅細胞分布均勻，既不重疊又互相緊靠相連。,圖3 各種血涂片的形狀,（二）瑞氏-姬姆薩染色法 1、原理 瑞氏染料是由酸性染料伊紅和堿性染料美藍組成的復合染料。各種細胞和細胞的各種成分化學性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此染色后在同一張血片上可以看到各種不同的色彩。例如血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染成粉紅色，稱為嗜酸性物

24、質(zhì)；細胞核蛋白核和淋巴細胞將為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染成藍色或紫色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒成等電狀態(tài)，與伊紅和美藍均可結(jié)合，染成紫紅色，稱為中性物質(zhì)。,瑞氏染料是由酸性染料伊紅和堿性染料亞甲藍組成的復合染料，是染料透入細胞并存留在細胞內(nèi)部的過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學的親和作用。,將適量的伊紅和亞甲藍溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇的作用（1）溶解伊紅和美藍，（2）脫水作用，固定細胞形態(tài)，（3）增加細胞結(jié)構(gòu)的表面積

25、，提高染料的吸附作用，增強染色效果。,pH影響 細胞各種成分均屬蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍結(jié)合，染色偏藍。因此，細胞染色對氫離子濃度十分敏感。染色所用的玻片必須清潔，無酸堿污染。配置必須使用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染液必須使用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性。,新鮮配制的染液偏堿，須在室溫或37°C下儲存一定時間，待染料成熟，

26、主要是讓美連逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆后才能使用，儲存時間越久，染色效果越好。染液儲存必須加塞，以防止甲醇揮發(fā)和被氧化成甲酸。,4、注意事項 （1）如果血膜未干透、細胞尚未牢固地附在載玻片上進行染色時，血膜容易脫落。 （2）染色時間與染液濃度、室溫、細胞多少有關(guān)。染液越淡、室溫越低、細胞越多，所需時間越長或應(yīng)適當增加染液量。 （3）染液不可過少，以防蒸發(fā)干燥。,（4）沖洗時應(yīng)用流水將染液沖掉。不能現(xiàn)倒掉染液，以免染料粘貼在血片上。染

27、色過深時可用甲醇或酒精適當褪色。 （5）染色過程中注意保證血膜尾部的完整性，以便觀察細胞形態(tài)。,（6）血液細胞染色的矯正 染色過深、過淺與血涂片中細胞數(shù)量、血膜厚度、染色時間、染液濃度、pH值密切相關(guān)。糾正過深的方法：可縮短染色是時間或稀釋染液或調(diào)節(jié)pH值；糾正過淺的方法：可延長染色時間或調(diào)節(jié)pH值。,（三）質(zhì)量控制 1、標本制備 涂片要薄厚適中、有頭、體、尾，染色要均勻、合適。 2、影響分類計數(shù)準確性的因素

28、主要是細胞在涂片上分布不均和觀察者對細胞辨認的差異。,（1）細胞分布不均 一般尾部中性粒細胞較多，淋巴細胞偏少。涂片越薄，分布越差；推片不光滑，細胞分布明顯不均。幼稚細胞一般出現(xiàn)在尾部。采用“城墻”式移動進行分類，可彌補分布差異。采用離心后制片，準確性可提高10%。,（2）形態(tài)識別 辨認差異主要集中在對分葉核和桿狀核的診斷標準上，也是室內(nèi)與室間質(zhì)控存在系統(tǒng)誤差的重要原因。一般認為，分葉核應(yīng)指分葉之間以細絲相連；但也有人認為只

29、要不足1/3即可。此外，單核細胞和大淋巴細胞、脫顆粒的嗜堿性粒細胞和中性粒細胞也難以區(qū)分。凡不能識別的細胞應(yīng)歸入“未能識別的白細胞”。提高涂片質(zhì)量和檢驗人員經(jīng)驗可克服上述問題。,3、影響分類計數(shù)精確性的因素精密度常用重復計數(shù)后計算S或CV來表示。人工分類計數(shù)準確性高，但精密度較差，這與分類計數(shù)的細胞數(shù)有限有關(guān)，提高計數(shù)數(shù)量可增加精密度。例如計數(shù)100、200、500和1000個白細胞，95%可信限分別為61-79%、63.5-76.6

30、%、66-74%和67-73%。,4、白細胞分類計數(shù)參考方法（按照NCCLS文件H20-A，1992） （1）標本用抗凝全血（EDTA-K3，1.5?0.15mg/ml全血）。 （2）（離體4小時內(nèi)）每個標本推血片三張，符合質(zhì)量要求。 （3）Romanowsky染色（羅氏）。,（4）符合以下要求：（A）紅細胞平均直徑SD為0.3?m，計數(shù)200個紅細胞，單個紅細胞直徑差不超過0.3?m（2SD）。（B）在適當計數(shù)區(qū)內(nèi)，當白細

31、胞計數(shù)大于4?109/L時，白細胞數(shù)不少于300個。（C）除病理狀態(tài)外，破損及無法辨認白細胞<2%。,（5）分類計數(shù)時，分中性分葉、桿狀、正常淋巴、單核、嗜酸、嗜堿及其它有核細胞。（A）每張片子計數(shù)200個白細胞。（B）白細胞減少病例在增加1張片子。（C）有核紅細胞以每100個白細胞有多少%表示。,（6）當以其他方法與此法作為標準進行比較時，需要4個熟練檢驗人員對同一張血涂片，各計數(shù)200個白細胞（即總數(shù)為800個白細胞）

32、后，求出平均值來作為各類白細胞的靶值。,四、外周血涂片白細胞分類 掌握要點： 1、良好推片和染色 2、選擇適合觀察的部位 3、按照“城墻式”觀察、識別、計數(shù) 4、掌握好中性粒細胞分葉核和桿狀核的鑒別 5、注意中性粒細胞的核象和中毒性改變 6、注意異常細胞，如異淋、幼稚細胞,表2 外周血五種白細胞形態(tài)特征-----------------------------------------------------

33、------------------------------- 細胞類型 外形 細胞核形 染色質(zhì) 細胞質(zhì)顏色 顆粒------------------------------------------------------------------------------------ 中性桿狀 圓形 臘腸樣 深紫色 淡桔紅色 量多、細小、均

34、 粗糙 勻、淺紫紅色 中性分葉 圓形 分葉狀 同上 同上 同上 嗜酸性 圓形 分2葉 深紫色 淡桔紅色 量多粗大、充滿 粗糙

35、 胞質(zhì)、鮮桔紅色 嗜堿性 圓形 分葉不清 粗而不均 淡桔紅色 量少、分布不均 覆蓋核上、藍黑 ---------------------------------------------------------

36、---------------------------,----------------------------------------------------------------------------------- 細胞類型 外形 細胞核形 染色質(zhì) 細胞質(zhì)顏色 顆粒--------------------------------------------------------------------

37、----------------淋巴細胞 圓形或 圓形或 深紫色 透明淡藍色 小淋巴無顆粒， 橢圓形 橢圓形 粗塊狀 大淋巴 可有少 數(shù)粗大深紫紅

38、 色顆粒 單核細胞 圓形或 不規(guī)則 淡紫紅色 淡灰藍色 量少細小、灰 不規(guī)則 腎形、 細致疏松 塵樣紫紅色、 馬蹄

39、形 呈網(wǎng)狀 彌散分布 扭曲折疊------------------------------------------------------------------------------------,嗜中性桿狀核 分葉核 嗜酸性粒細胞 嗜堿性粒細胞,小淋巴細胞 大淋

40、巴細胞 單核細胞,（二）中性粒細胞核象 1、定義 指外周血中性粒細胞的分葉狀況。 2、正常核象 以3葉核為主，分葉核與桿狀核的比例為13：1，沒有幼稚細胞。,3、核左移 血片中以桿狀核為主，或者同時伴有幼稚細胞出現(xiàn)。重度核左移（桿狀核粒細胞>25%）并出現(xiàn)更多的幼稚粒細胞，又稱為類白血病反應(yīng)。核左移常見于感染（尤其是化膿性感染）、急性中毒、急性溶血、急性失血等。,4、核右移 血片中以5葉核以上超過3%，

41、此時常伴有白細胞總數(shù)減少。核右移主要見于巨細胞性貧血、使用抗代謝藥后、炎癥恢復期；但在疾病進行期突然出現(xiàn)核右移，則表示預后不良。,（三）中性粒細胞中毒性變化 中性粒細胞的毒性變化 在嚴重傳染病、各種化膿性感染、敗血癥、惡性腫瘤、中毒、大面積燒傷等病理情況下，中性粒細胞可發(fā)生以下變化：,1、中毒顆粒 比正常中性顆粒粗大，大小不等，分布不均，染色較深，呈紫色或紫黑色。 2、空泡 胞漿內(nèi)不著色的小泡，可為單個，常為多個，大小不等。

42、 3、退行性變 常見的有胞體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，邊緣不清晰，核固縮，核腫脹和核溶解等。如胞漿破裂，顆粒消失，則成裸核細胞；裸核細胞腫脹破裂，即成籃細胞，又稱涂抹細胞。,圖4 中性粒細胞中毒性改變,圖5 中性粒細胞中毒顆粒和Dohle小體,圖6 中性粒細胞核退行性變,（四）異形淋巴細胞 在傳染性單核細胞增多癥、病毒性肺炎、流行性出血熱、濕疹、過敏性疾病等病毒性感染或過敏原刺激下，可使淋巴細胞增生，并出現(xiàn)某些形態(tài)變化，根

43、據(jù)形態(tài)分為以下三型：,1、空泡型 胞體比正常淋巴細胞大，多為圓形、橢圓形或不規(guī)則，核圓形、腎形或分葉狀，常偏位；核染色質(zhì)粗糙呈粗網(wǎng)狀或小塊狀，排列不規(guī)則；胞漿豐富，染深藍色，含空泡或呈泡沫狀。,2、不規(guī)則型 胞體較大，外形不規(guī)則，可有多數(shù)偽足；核形狀及結(jié)構(gòu)與空泡型相同或更不規(guī)則，染色質(zhì)粗糙致密；胞漿豐富，淡藍或灰藍色，有透明感，邊緣著色較深，一般無空泡，可見到少量紫紅色嗜天青顆粒。 3、幼稚型 胞體較大，核圓形或卵圓形；染色質(zhì)細

44、致呈網(wǎng)狀排列，可見1～2個核仁；胞漿深藍色，可有少數(shù)空泡。,正常淋巴細胞異常淋巴細胞,圖8 異常淋巴細胞（核仁型）,圖9 異常淋巴細胞（幼稚型）,圖10 異常淋巴細胞（不規(guī)則型）,圖11 異常淋巴細胞（核仁型）,（五）幼稚細胞 形態(tài)特點： 1、細胞體積大 2、核大、有核仁、染色質(zhì)細致均勻 3、胞漿深藍，無顆粒或有顆粒,圖12 幼稚細胞：原始粒細胞（左），原始單核細胞（右）,圖13

45、幼稚細胞：慢粒（左），慢淋（右）,五、血細胞分析儀的原理、直方圖分析方法及儀器使用的注意事項 血細胞分析儀可以對抗凝全血或稀釋后的末梢血標本進行檢測，在短時間內(nèi)準確給出細胞計數(shù)、體積測定、血紅蛋白分析、白細胞分類等多項參數(shù)，此外還可以提供細胞分布的直方圖，大大提高了細胞檢測的準確性和工作效率。根據(jù)血細胞分析儀的檢測功能可以將其分為兩分類、三分類和五分類三種類型，依照社區(qū)醫(yī)院的儀器配置情況，本教材僅介紹電阻抗法三分類血細胞分析儀的工作

46、原理和應(yīng)用。,（一）電阻抗細胞檢測原理 在等滲電解質(zhì)溶液（稀釋液）中，有一個用于細胞計數(shù)的小孔管。小孔管外側(cè)細胞懸液（稀釋液）中有一個外電極。其內(nèi)側(cè)也充滿同樣的稀釋液，并有一個內(nèi)電極。細胞為相對不良導體，其導電性質(zhì)比稀釋液低，當有一個細胞通過小孔時，瞬間可引起電壓變化而出現(xiàn)一個脈沖信號。脈沖數(shù)量的多少與細胞的數(shù)量成正比，脈沖的高低與細胞體積大小成正比。圖1顯示出血細胞計數(shù)儀應(yīng)用電阻抗原理進行細胞計數(shù)及體積分析的方法及過程。,圖14-

47、1 電阻抗原理示意圖（一）,圖14-2 電阻抗原理示意圖（二）,圖14-3 電阻抗原理（三）,（二）操作程序在進行血細胞測定之前，全血標本必須用稀釋液在儀器的外部或內(nèi)部進行一定比例的稀釋，一般用1：251的稀釋倍數(shù)來測量白細胞，例如庫爾特公司的JT系列血液分析儀是用6ml稀釋液來稀釋28ul全血。,為了使紅細胞全部被破壞，再加入1ml溶血劑使紅細胞膜破裂，釋放出血紅蛋白，僅留下紅細胞膜微小的殘余部分。儀器將從白細胞計數(shù)

48、池中測量到的大于35fl的電子脈沖的數(shù)量作為白細胞計數(shù)，根據(jù)細胞稀釋倍數(shù)進行計算，得到正確的白細胞計數(shù)結(jié)果。,所以，血球分析儀需要三種試劑：稀釋液、溶血劑和清洗液。按照要求，應(yīng)當使用和儀器相配套的試劑。如果使用其他生產(chǎn)商或自己研制的試劑，一定要和原裝配套試劑進行比對試驗，不僅計數(shù)結(jié)果相一致，而且三個細胞直方圖也必須一致。否則不能使用。,圖15 三分類血球分析儀工作流程圖,血球分析儀報告內(nèi)容 一般包括三個部位： 1、計數(shù)參數(shù)

49、（直接計數(shù)和計算） 2、細胞直方圖 3、警示符號（旗號）,（三）直方圖 許多儀器除給出細胞計數(shù)外，還提供細胞體積分布圖形，這些可以表示細胞群體分布情況的圖形被稱為直方圖。它可以顯示出某一特定細胞群的平均細胞體積、細胞分布情況和是否存在明顯的異常細胞群。直方圖是由測量通過感應(yīng)區(qū)的每個細胞脈沖累積得到，根據(jù)電阻抗原理可以在計數(shù)細胞數(shù)量的同時進行體積分析測量。如圖14所示，左圖為示波器顯示的所分析細胞的脈沖大小，右圖為相應(yīng)的體

50、積分布直方圖，橫坐標為體積，縱坐標為相對數(shù)量。,圖16 血細胞直方圖形成原理示意圖,1、白細胞直方圖及分類計數(shù)方法 （1）正常白細胞直方圖（見圖15）：有3個峰的光滑曲線，從左至右有3個相應(yīng)細胞群：第一群是小細胞區(qū)，主要是淋巴細胞（lymph），其峰較高；第二群是單個核細胞區(qū)(mono)，包括單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞（病理細胞，包括核象左移、各階段幼稚細胞及白血病細胞等），其峰較低平。第三群是大細胞區(qū)，主要是中性粒

51、細胞(Gran)，其峰較寬而低。,圖17 三分類白細胞直方圖,（2）分類計算方法：電阻抗法得到的白細胞分類結(jié)果是根據(jù)各群細胞在白細胞直方圖上所占面積的大小計算得來的（見圖14）。由于白細胞計數(shù)池中除加入一定量的稀釋液外還加入了溶血劑，此溶血劑一方面使紅細胞溶解，另一方面使白細胞漿經(jīng)胞膜滲出，胞膜緊裹在細胞核和存在的顆粒周圍。,儀器將體積在35～450fl范圍內(nèi)的顆粒認定為白細胞（不同廠家的儀器體積設(shè)定略有不同），并根據(jù)其體積大

52、小在直方圖上從左至右初步確認其相應(yīng)的三個細胞群。儀器根據(jù)各細胞群占總體的比例計算出相應(yīng)的百分比，如果與該標本的白細胞總數(shù)相乘，即得到各類細胞的絕對值。,圖18 白細胞分類計數(shù)公式,圖19 正常白細胞三分類直方圖,表5 白細胞體積三分類-------------------------------------------------------------------細胞類型 體積范圍 包

53、含的細胞成分-------------------------------------------------------------------小細胞群 30-100fl 淋巴細胞中間細胞群 100-150fl 單核細胞，嗜酸性粒細胞， 嗜堿性粒細胞，

54、 原始或幼稚細胞大細胞群 150-300fl 中性分葉核粒細胞-------------------------------------------------------------------,（3）病理性直方圖：從白細胞直方圖圖形的變化可以估計被測血液中細胞群體的變化。當白細胞分類的比例異?；虺霈F(xiàn)異常細胞時，白細胞直方圖曲線峰的高低、數(shù)量和低

55、谷區(qū)的特征將會出現(xiàn)一些變化，并顯示相應(yīng)的報警。,圖20 中性粒細胞增高白細胞三分類直方圖,圖21 中性粒細胞減少白細胞三分類直方圖,圖22 單核細胞或嗜酸性粒細胞或異常淋巴細胞 增高白細胞三分類直方圖,圖23 異常淋巴細胞增高白細胞三分類直方圖,圖24 急性淋巴細胞性白血病白細胞三分類直方圖,圖25 急性淋巴細胞白血?。↙1）外周血象,圖26 急性淋巴細胞白血病白細胞三分類

56、直方圖,,圖27 急性淋巴細胞白血病白細胞（L2）外周血象,圖28 急性淋巴細胞白血?。↙3）外周血象,圖29 慢性淋巴細胞白血病白細胞三分類直方圖,圖30 急性非淋巴細胞性白血病白細胞三分類直方圖,圖31 淋巴細胞增高和急性白血病在直方圖的表現(xiàn),圖32 急性非淋巴細胞性白血病（M1）外周血象,圖33 急性非淋巴細胞性白血?。∕2）外周血象,圖34 急性非淋巴細胞性白血病（M3）外周血象,圖35 急性

57、非淋巴細胞性白血病（M4）外周血象,圖36 急性非淋巴細胞性白血?。∕5）外周血象,所以，當發(fā)現(xiàn)某患者白細胞直方圖改變?yōu)橐粋€單一峰的曲線，務(wù)必要對血涂片進行檢查，以排除急性白血病。千萬不要漏診。,其它種異常對白細胞直方圖的影響 某些病理性紅細胞及新生兒紅細胞對溶血劑有較強的抵抗力，使之不溶解或不完全溶解；存在有核紅細胞；存在血小板聚集等。此時白細胞直方圖也可發(fā)生相應(yīng)的改變，并導致白細胞計數(shù)錯誤。因此，當實驗結(jié)果出現(xiàn)這些圖形時

58、，提示白細胞計數(shù)和分群結(jié)果均不準確，需要復查。各種干擾因素引起的白細胞直方圖變化見圖37。,圖37 受干擾的白細胞直方圖a.聚集的血小板干擾b.不完全溶解的紅細胞干擾,c.巨大血小板干擾 d.冷球蛋白干擾,綜上所述，通過對白細胞直方圖的分析可以初步判斷各種類型白細胞的狀況以及細胞計數(shù)的準確性。但直方圖并不能顯示出所有的異常，而且很多異常情況顯示出的圖形相似，很難區(qū)分，必須通過顯微鏡細胞分析方

59、法做出確切的判斷。所以自動血細胞分析儀并不能完全取代傳統(tǒng)的顯微鏡分析方法。,2、紅細胞直方圖 各種類型紅細胞直方圖見圖38-39。 （1）正常直方圖：正常紅細胞大小較一致，紅細胞直方圖呈光滑的正態(tài)曲線（單峰）。峰值即紅細胞平均體積，曲線底邊寬度可顯示出紅細胞體積分布寬度（RDW）情況。紅細胞大小檢測范圍一般在35～250fL。同白細胞一樣，不同廠家的檢測范圍有所不同。,圖38 正常紅細胞直方圖,（2）病理性直方圖： 缺鐵性

60、貧血的直方圖，其特點為曲線波峰左移，峰底變寬，顯示小細胞不均一性。輕型β珠蛋白生成障礙性貧血的直方圖，表現(xiàn)為小峰左移，峰底變寬，典型的小細胞均一性貧血。鐵粒幼細胞性貧血的直方圖，紅細胞呈典型的“雙形”性改變，即同時存在著兩種類型的紅細胞，一種是低色素性紅細胞，另一種是正常形態(tài)的紅細胞。,巨幼細胞性貧血的直方圖，治療前直方圖波峰右移，峰底增寬，顯示明顯的大細胞不均一性；治療后，出現(xiàn)雙峰形，說明治療有效。急性失血性貧血直方圖的曲線峰變低，其

61、它特點與正常紅細胞直方圖一致。,圖39 不同類型貧血時紅細胞直方a.缺鐵性貧血（峰值左移、曲線底部增寬）,b.輕型β-海洋性貧血（峰值左移、曲線底部不增寬）,c.鐵粒幼細胞性貧血 （曲線出現(xiàn)雙峰）,d.巨幼細胞性貧血（峰值右移，底部增寬）,e.急性失血性貧血（峰值和曲線底部寬度均正常）,紅細胞冷凝集干擾的直方圖在37℃水浴前，紅細胞直方圖的曲線峰明顯變低，而且在150～250fl可見一個很低的大細胞峰。標本在37℃水浴30min后

62、測試，紅細胞各參數(shù)值和直方圖恢復到實際狀態(tài)。,圖40 紅細胞冷凝集素對紅細胞直方圖的干擾 a.紅細胞冷凝集水浴前 b.紅細胞冷凝集水浴37℃后,應(yīng)該指出，不同型號儀器的特點及使用稀釋液不同，紅細胞分布曲線的形狀亦有差異，但反映病理變化的基本特征是相同的，上述內(nèi)容只是描述的某一型號儀器的圖形變化。在實際工作中，不同實驗室應(yīng)根據(jù)自身儀器的特點進行對比分析。,3、血小板直方圖 見圖41。（1）正常直方圖：正常血小

63、板直方圖是一條光滑、峰偏左的偏態(tài)曲線，分布在2～30 fl范圍。,圖41 血小板正常的直方圖,（2）異常直方圖： 由于血小板與紅細胞在同一個通道內(nèi)測量，而二者在體積上有明顯的差異，故儀器設(shè)定了特定的閾值，將高于閾值者定于紅細胞，反之為血小板。但紅細胞群體中的小紅細胞或細胞碎片可落在血小板的閾值內(nèi)，巨大血小板或聚集的血小板可誤認為紅細胞，這些均可從血小板直方圖上反映出來。另外，乳糜微粒、冷球蛋白顆粒和紅細胞冷凝集等也可干擾血小板計

64、數(shù)結(jié)果，但血小板直方圖無明顯的變化。,圖42 不同干擾情況下的血小板直方圖a、大血小板直方圖（曲線后半部分增寬和延伸）,b、小血小板直方圖（曲線后半部分縮窄）,c、聚集的血小板直方圖（曲線后半部分上揚并延伸、血小板計數(shù)假性減低）,d、聚集的血小板直方圖（曲線平坦并延伸、血小板計數(shù)假性減低）,e、小紅細胞干擾的血小板直方圖（曲線尾部抬高、延伸、血小板計數(shù)假性增高）,（三）其它血液檢驗項目的檢測方法 1、血紅蛋白測定原理

65、稀釋的血液加入溶血劑后釋放出血紅蛋白，后者與溶血劑結(jié)合形成穩(wěn)定的血紅蛋白衍生物。在特定波長（一般530~550nm）下比色，吸光度的變化與液體中的血紅蛋白含量成比例。,2、紅細胞壓積的測定原理 絕大多數(shù)血細胞分析儀使用電阻抗法進行紅細胞壓積測定（Hct）。紅細胞通過小孔時，由于電阻抗作用，產(chǎn)生脈沖，脈沖的多少即是紅細胞的數(shù)量，脈沖的高度取決于單個細胞的體積。脈沖高度疊加經(jīng)換算即可得到紅細胞壓積。有的儀器先以單個脈沖高度計算MCV，再

66、乘以紅細胞數(shù)得出紅細胞壓積。,3、電阻抗法進行白細胞計數(shù) 分析儀首先將血標本進行稀釋（一般為1：250），加入溶血劑將紅細胞溶解，在白細胞池中利用電阻抗法（庫爾特原理）計數(shù)白細胞數(shù)。 4、電阻抗法進行紅細胞和血小板計數(shù) 分析儀首先將血標本進行高倍稀釋（一般為1：25000），在紅細胞池中利用電阻抗法將大脈沖輸入紅細胞通道，將小脈沖輸入血小板通道，從而得出紅細胞和血小板數(shù)。,5、MCV（平均紅細胞體積）、MCH（平均紅細胞血紅蛋白

67、）和MCHC（平均紅細胞血紅蛋白濃度）的檢測原理 它們都是根據(jù)儀器檢測的紅細胞數(shù)、紅細胞壓積和血紅蛋白含量的數(shù)據(jù)，經(jīng)內(nèi)存電腦換算出來的，計算公式為：MCV（fl） = Hct/RBC MCH（pg）= Hgb/RBCMCHC（g/L） = Hgb/Hct 其中MCV對應(yīng)的是紅細胞直方圖曲線的波峰。,表6 貧血的形態(tài)學分類----------------------------------------------

68、-----------------------------形態(tài)學分類 MCV MCH MCHC 具體疾病舉例 （fl） （pg） （g/L）---------------------------------------------------------------------------正細胞正色素 80-100 26-32 32-36

69、 急性失血、急性溶性貧血 血、再生障礙性貧血小細胞低色素 <80 <26 <32 缺鐵性貧血、慢性貧性貧血 失血、珠蛋白合成障礙-------------------------------