內(nèi)毒素及β葡聚糖檢測

1、內(nèi)毒素和1，3-β-D-葡聚糖檢測的臨床應(yīng)用,,主要內(nèi)容,來源及結(jié)構(gòu),生物學(xué)活性,檢測的臨床應(yīng)用,檢測方法及參考范圍,標(biāo)本采集及影響因素,,,內(nèi) 毒 素,內(nèi)毒素的生物學(xué)活性,,內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu),,特異性多糖,核心多糖,類脂A,內(nèi)毒素概述,內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖（LPS），這些成分只在細(xì)菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。,內(nèi)毒素的有益作用,,內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因,,,,有效的抗菌治療后，細(xì)菌崩解,,輸入

2、了含有細(xì)菌的藥物、血液或者體液等。,各類疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)性肝炎58-100%、丙肝60%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。,內(nèi)毒素檢測的臨床應(yīng)用,,,內(nèi)毒素檢測在醫(yī)院中的應(yīng)用,,內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀,內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內(nèi)毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細(xì)

3、胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。 ▲最嚴(yán)重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。,內(nèi)毒素的檢測方法,鱟試驗是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細(xì)胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷試劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的一種方法。,內(nèi)毒素的檢測方法,1.凝膠法：鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)

4、毒素的方法2.濁度法：利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量3.比色法：利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量4.流式細(xì)胞術(shù)：測內(nèi)毒素的量而不是活性5.化學(xué)發(fā)光測定法,內(nèi)毒素的檢測原理,革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：革蘭陰性菌脂多糖能激活酶反應(yīng)主劑中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液

5、吸光度變化對革蘭陰性菌脂多糖濃度進行測定。,,,,MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng),內(nèi)毒素檢測的參考值,檢測值﹤10pg/ml,陰性。檢測值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥20pg/ml，陽性，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。,檢測方法的局限性,只能檢測革蘭陰性菌脂多糖含量，不能區(qū)分細(xì)菌種屬。,檢測樣本的采集與保存,檢測樣本：血液采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管（肝素類抗凝

6、）。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應(yīng)在3000轉(zhuǎn)/分進行離心，若不能及時檢測，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無熱原試管內(nèi)，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。特殊標(biāo)本處理 ：對一般黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，稀釋2-5倍后進行檢測 ；對于嚴(yán)重的黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，應(yīng)重新采血。,干擾因素,1.應(yīng)用某些抗生素如β-酰胺內(nèi)酯類、喹諾酮類等患者；2.一些蛋白：陽離子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A及人免疫球蛋

7、白G均能與內(nèi)毒素形成細(xì)菌內(nèi)毒素--蛋白復(fù)合體，對細(xì)菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，而影響測定內(nèi)毒素結(jié)果；3.操作環(huán)境及操作過程中的污染，可能造成假陽性。,,,,,(1-3)-?-D-葡聚糖,1-3-β-D-葡聚糖本質(zhì)及特點,,(1-3)-β-D-葡聚糖特性,1.對熱極為穩(wěn)定，高壓21℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含量較多，對G試驗靈敏。2.當(dāng)真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚

8、糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。3.在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高。,侵襲性真菌感染的定義,侵襲性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)定義: 指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。,侵襲性肺部真菌感染,侵襲性真菌感染的發(fā)

9、病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染最常見,大約占50%～60%。未經(jīng)及時治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達30% ～80% 。,侵襲性肺部真菌感染,臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血、胸悶、呼吸困難等。 現(xiàn)狀：兩高兩低一快 高院內(nèi)感染率和病死率，低臨床和實驗 室診斷率，患者病情惡化快。 （檢測方法相對滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的新型抗真菌藥物價格昂貴

10、,導(dǎo)致病死率高。）,侵襲性真菌感染的誘因,內(nèi)源性誘因： 影響機體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結(jié)核、肺膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等。外源性誘因： ▲廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑； ▲插管等侵襲性治療，骨髓和實體器官移植； ▲免疫缺陷綜合癥。,侵襲性真菌感染診斷困難的原因,診斷困難的主要原因：臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋確診常需侵入性手段獲得組織標(biāo)本，侵入性操作常因患者的病情所限難以實施真

11、菌檢測項目開展相對不足或滯后,,,侵襲性真菌感染的特點,不產(chǎn)生內(nèi)毒素和外毒素，致病機理不明；致病力一般較弱，機體免疫低下時發(fā)生；感染菌種變化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長趨勢上升明顯；早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。,主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病,呼吸系統(tǒng)疾病：肺炎、肺纖維癥感染及寄生蟲?。悍谓Y(jié)核、腹腔內(nèi)膿腫、AIDS循環(huán)系統(tǒng)疾病：腦出血、腦梗塞、硬膜下血瘤術(shù)后、胸部大動脈瘤術(shù)后內(nèi)分泌

12、疾病：糖尿病血液及造血器官疾?。涸偕系K性貧血、DIC腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤,“G”試驗,1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。,G試驗檢測評價,BG值在侵襲性真菌感染臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值相關(guān)報道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)以前 。平均早于發(fā)熱5

13、d早于呼吸道癥狀10d,G試驗臨床應(yīng)用,1　明確診斷　　（抗真菌藥物治療前）　2　治療效果監(jiān)測　?。拐婢幬镏委熀螅?　連續(xù)2次采血進行G試驗,,侵襲性真菌感染的臨床檢測方法,直接培養(yǎng)真菌法--敏感性低，耗時長, 培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)結(jié)果是定性的，有些標(biāo)本采集困難G試驗：通過檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染。耗時短，靈敏度高，特異性強，定量檢測可判斷感染嚴(yán)重程度PCR技術(shù)：真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)

14、物的血清學(xué)檢查和真菌核酸檢測,,真菌1-3-β-D葡聚糖檢測原理,真菌1-3-β-D葡聚糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：真菌1-3-β-D葡聚糖能特異性激活反應(yīng)主劑中的G因子、凝血酶原等，發(fā)生酶的級聯(lián)反應(yīng)從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對真菌1-3-β-D葡聚糖濃度進行定量。 試劑中添加的兩性電解質(zhì)甘氨酸、氨基糖苷類抗生素及表面活性劑可抑制脂多糖對B、C因子的激活，對革蘭陰性菌脂多糖有特異性屏蔽作用。,,,MB-80微

15、生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng),真菌1-3-β-D葡聚糖參考值,檢測值﹤60pg/ml,陰性。檢測值介于60～100pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥100pg/ml，陽性(深部真菌感染)，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。,,檢測方法的局限性,只能檢測真菌1-3-β-D葡聚糖的含量，不能區(qū)分真菌種屬，不能檢測結(jié)合菌和隱球菌。,,內(nèi)毒素與β-葡聚糖的檢測比較,已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌1-3-β-D葡聚糖，但它

16、們的反應(yīng)曲線不一樣。內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。,念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色,對于念珠菌血癥, G試驗檢測是首選檢查熱帶念珠菌----灰藍色白色念珠菌 ----綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色,標(biāo)本采集及保存,檢測樣本：血液、肺細(xì)胞灌洗液采集要求： 1.采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管； 2.常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采

17、血，血透析患者透析前采血,,,標(biāo)本采集及保存,及時送檢，及時檢測：2-3h內(nèi)檢測不合格標(biāo)本：嚴(yán)重黃疸、溶血、乳糜標(biāo)本會影響測結(jié)果，需重新采血進行檢測。,,,干擾因素,據(jù)報道可能產(chǎn)生假陽性的原因有： 1.應(yīng)用纖維素膜進行血液透析患者; 2.某些紗布或其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖; 3.靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白）等含有葡聚糖;,,,干擾因素,4.某些細(xì)菌敗血癥患者（尤其是鏈球菌敗血癥）; 5.抗腫瘤類藥物(香

18、菇多糖、裂殖菌多糖); 6.磺胺類藥物; 7.蘑菇類食物;,,,臨床細(xì)菌內(nèi)毒素及(1-3)-?-D-葡聚糖檢測的國內(nèi)外發(fā)展,國外：血液（包括血漿、腦脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中內(nèi)毒素以及(1-3)-?-D-葡聚糖微量定量檢測已經(jīng)成為現(xiàn)實，目前在美國、日本等國均已出現(xiàn)專用細(xì)菌內(nèi)毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測儀器及配套的檢測試劑盒，而且獲得FDA及厚生省批準(zhǔn)文號，作為一種日常檢測項目。,,,臨床細(xì)菌內(nèi)毒素