石蠟切片技術(shù)-顯微鏡門(mén)戶-中國(guó)顯微圖像網(wǎng)

1、顯微標(biāo)本制作技術(shù),河北大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,一、實(shí)驗(yàn)原理,顯微標(biāo)本的制作技術(shù)是組織學(xué)，胚胎學(xué)，生理學(xué)及細(xì)胞學(xué)等學(xué)科研究觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要方法。大多數(shù)的生物材料，在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無(wú)法看到其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因?yàn)椴牧陷^厚，光線不易透過(guò)，以致不易看清其結(jié)構(gòu)，另外細(xì)胞內(nèi)的各個(gè)結(jié)構(gòu)，由于其折射率相差很小，即使光線可透過(guò)，也難以辯明。但在經(jīng)過(guò)固定，脫水，透明，包埋等手續(xù)后就可把材料切成較薄的片子，再用不同的染色方

2、法就可以顯示不同細(xì)胞組織的形態(tài)及其中某些化學(xué)成份含量的變化，就可以在顯微鏡下清楚的看到其中不同的區(qū)域組分狀態(tài)，切片也便于保存，所以是教學(xué)和科研中常用的方法。,二、實(shí)驗(yàn)方法,生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類(lèi)： 非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等。 切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。 顯微制片技術(shù)雖是生物學(xué)中很基本的操作技術(shù)，但由于生物材料的個(gè)體差異，化學(xué)

3、試劑的多樣性，因此操作技術(shù)相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，才能得到較好的結(jié)果。,即不用切片機(jī)，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類(lèi)方法操作簡(jiǎn)單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞，涂片法，壓片法彌補(bǔ)了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標(biāo)本制備的中常用的手段。 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰

4、液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。,1、非切片法,1.2 鋪片法 主要用于動(dòng)、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動(dòng)、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。 如: 洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。1.3 壓片法 一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，

5、再進(jìn)行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。,1.4 離析法 該方法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解，使細(xì)胞能分散成單個(gè)個(gè)體。經(jīng)染色，脫水，透明即可觀察其個(gè)體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。1.5 磨片(Ground section) 用于很堅(jiān)硬的組織，如骨和牙。,2 、切片法 切片法是必須依靠手或切片機(jī)將組織切成薄片來(lái)進(jìn)行觀察的方法，為了能清晰地觀察到動(dòng)、植物的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必

6、須先經(jīng)過(guò)一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類(lèi)不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類(lèi)型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標(biāo)本。 下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標(biāo)本的制備方法。,2.1 取材 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。 所采集材料應(yīng)立即放入固定劑，并編號(hào)

7、，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng)，即要能說(shuō)明問(wèn)題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，植物組織取材稍小，動(dòng)物組織取材要稍大。,2.1.1動(dòng)物的麻醉和殺死 從活的動(dòng)物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因?yàn)樵诓皇┘勇樽淼那闆r下，有的動(dòng)物會(huì)收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會(huì)騷動(dòng)(如蛙、鼠)，使我們無(wú)法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細(xì)胞學(xué)方面的研究對(duì)材料的新

8、鮮程度要求更嚴(yán)。因此，要割取生活著的動(dòng)物組織，在一般情況下，就要對(duì)動(dòng)物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)為原則。,若是一般的組織學(xué)制片，要求不太嚴(yán)格的話則可將動(dòng)物先殺死然后速取其組織進(jìn)行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動(dòng)物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動(dòng)物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動(dòng)物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。,上述

9、動(dòng)物若需麻醉后取材，則可用脫脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于動(dòng)物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動(dòng)物(狗、猴等)應(yīng)用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉．劑量一般為每kg動(dòng)物體重用1 g。麻醉后的動(dòng)物也需放血后進(jìn)行取材固定。 昆蟲(chóng)等小動(dòng)物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要?dú)⑺?，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中?2.1.2動(dòng)物組織塊的切割 割取動(dòng)物組織塊時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)： 第一，要考慮所取的材料應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)或全部

10、結(jié)構(gòu)，如消化管就應(yīng)包括粘膜、粘膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)。若所取的器官太大，不易全部制片時(shí)，則可切取能代表該器官的部分材料，如狗的腎臟，可切取包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂的一部分為材料。 第二，應(yīng)注意切割方向．如在管狀器官(腸等)取材時(shí)，一般是取其橫切面制片，但要觀察小腸的環(huán)行皺壁時(shí)，就應(yīng)取其縱切面制片。,第三，組織塊必須切得小而薄。細(xì)胞學(xué)制片的組織塊不能超過(guò)2mm，一般組織塊的大小以0.5*0.5*0.2cm為宜，柔軟組織不易切小,

11、可先取稍大的組織塊固定2 - 3h。等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。,2.2固定,割取組織塊后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。 固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。 2.2.1固定的意義 新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一 種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且有利于保存

12、和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。,固定的目的和作用在于：①防止組織自溶和腐??；②使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來(lái)從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時(shí)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；③因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來(lái)在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見(jiàn)，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色；④固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，

13、有利于操作。,2.2.2固定的方法 固定有物理方法和化學(xué)方法兩種。 物理方法固定有干燥、高熱和低溫騾冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細(xì)菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學(xué)反應(yīng)的制片是以低溫騾冷固定作冰凍切片的。 化學(xué)方法固定就是用化學(xué)試劑配制成固定液使之固定。,2.2.3固定液的選擇 固定液的種類(lèi)很多?？煞譃閮纱箢?lèi)：簡(jiǎn)單固定液和混合固定液。 簡(jiǎn)單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學(xué)試劑作

14、為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對(duì)細(xì)胞的某種成分固定得較好；不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來(lái)。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無(wú)水乙醇可固定糖原等，單純固定液是有局限性的。 混合固定液就是用幾種化學(xué)藥品，按一定的比例混合配制而成的，由于各種藥品的優(yōu)缺點(diǎn)互相彌補(bǔ)，因此可產(chǎn)生較好的效果。,2.2.4常用的固定液福爾馬林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技術(shù)中較為良好的固定液和保存液。除

15、單細(xì)胞和絲狀藻類(lèi)外，均可用此液固定．也通用于昆蟲(chóng)和甲殼類(lèi)的固定。 FAA液配方： 福爾馬林 5m1 冰醋酸 5m1 50％或70％酒精 90m1,Bouin氏液 是常用的良好固定液，廣泛應(yīng)用于一般動(dòng)物組織、昆蟲(chóng)組織、無(wú)脊椎動(dòng)物的卵和幼蟲(chóng)，以及胚胎學(xué)材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。 Bouin氏液配方： 苦味酸飽和水

16、溶液 75份 福爾馬林 25份 冰醋酸 5份 此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動(dòng)物組織固定12—24h，小塊組織數(shù)小時(shí)即可。固定后直接入70％酒精中洗去黃色，但留一點(diǎn)黃色對(duì)染色并無(wú)妨礙。植物材料的固定時(shí)間為12—48h。,2.2.5固定的注意事項(xiàng) (1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預(yù)先準(zhǔn)備好的固定液中

17、進(jìn)行固定，切勿耽誤。 (2)材料大小以直徑不超過(guò)5mm為宜，材料與固定液的比例為 1:20。 (3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有氣泡的材料投入團(tuán)定液后，材料不會(huì)下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡(jiǎn)易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動(dòng)幾次。也小用抽氣裝置進(jìn)行抽氣。,(6)固定時(shí)，要防止

18、材料變形。 (7)外有被膜，而內(nèi)部站構(gòu)又極易松散的器官，應(yīng)將整個(gè)器官投入固定液2—2h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈后．再行固定。 (9)材料投入固定液后．須經(jīng)常搖晃。(10) 容器外需貼標(biāo)簽。,2.3 脫水 脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來(lái)逐漸置換樣品中游離的水。 現(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來(lái)進(jìn)行梯度脫水，脫水的時(shí)間，可根據(jù)組

19、織的類(lèi)型，大小而定。 脫水的過(guò)程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100% 脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大進(jìn)行，否則將引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形，在經(jīng)無(wú)水乙醇處理時(shí)，應(yīng)保證試劑的純度。,2.4 透明 透明是用一種即能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來(lái)置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個(gè)有利的條件。 現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 其過(guò)程為： 1/3

20、二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。,2.5 滲蠟 將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包理與切片。 石蠟有液態(tài)與

21、固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60°c）中進(jìn)行，以保證石蠟處于液態(tài)中。,2.6 包埋 樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時(shí)還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。 將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。 至此，一塊組織已完成前處理過(guò)程，可以切片，前邊的步驟看來(lái)既無(wú)高深的理

22、論，又無(wú)復(fù)雜的技術(shù)，一切看似簡(jiǎn)單，但一步做不到都會(huì)造成整個(gè)制片的前功盡棄。,我們可以看到： ①水和酒精可以相溶。 ②酒精和二甲苯相溶。 ③二甲苯和石蠟可以相溶。 因?yàn)橐陨舷噜彶襟E所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個(gè)步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個(gè)步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細(xì)小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也

23、就切不成良好的切片。,2.7 切片修塊： 切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開(kāi)，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周?chē)氖炏嗟?。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺(tái)上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切片的蠟片連成一長(zhǎng)條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺(tái)上展平，烘干。,2.8.1染料、染色液染料必須具備兩個(gè)條件： ①

24、要具有顏色 ②和被染物體之間具有親和力。 如果只有顏色而與被染物體之間無(wú)親和力，那只能是顏料或合色物質(zhì)，而不是染料。染料的顏色和親和力都是由分子結(jié)構(gòu)決定的，即由產(chǎn)生顏色的發(fā)色團(tuán)和與組織產(chǎn)生親和力的助色團(tuán)所決定。 發(fā)色團(tuán)：能使染料分子產(chǎn)生顏色的原子團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)，也就是能吸收一定波長(zhǎng)的光線并因之而呈現(xiàn)顏色的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 助色團(tuán)：能使染料對(duì)織物纖維或組織成分產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)稱為助色團(tuán)，也就是使化合物具有成鹽性

25、質(zhì)的原子團(tuán)。,2.8染色,2.8.2染色劑的分類(lèi) 2.8.2.1根據(jù)來(lái)源分 (l)天然染色劑 此類(lèi)染色劑是從動(dòng)、植物體中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍(lán)等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。 (2)合成染色劑 全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構(gòu)成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。 除上述兩類(lèi)外，在生物染色中還使用一些無(wú)機(jī)化

26、合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。,2.8.2.2根據(jù)用途分 (l)細(xì)胞核染色劑 用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。 (2)細(xì)胞質(zhì)染色劑 用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。 （3）脂質(zhì)染色劑 用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、

27、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。,2.8.2.3根據(jù)染色劑的化學(xué)性質(zhì)分 堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。 堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構(gòu)成的鹽類(lèi)。 堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)別，就在于染色劑的主要有色部分是陽(yáng)離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽(yáng)離子為堿性染色劑．若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。,2.8.2染色原理 有關(guān)染色的理論至今是一個(gè)并

28、末完全清楚的很復(fù)雜的問(wèn)題。目前一般還是從物理和化學(xué)的作用來(lái)解釋各種組織或細(xì)胞的染色現(xiàn)象。 2.8.2.1染色的物理作用 此理論認(rèn)為組織細(xì)胞的染色是以物理作用為基礎(chǔ)的，主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，使染色劑進(jìn)入組織或細(xì)胞內(nèi)。 (1)毛細(xì)管作用及滲透作用 但染色劑與組織細(xì)胞沒(méi)有牢固的結(jié)合 (2)吸收作用 又稱溶解學(xué)說(shuō)。這種學(xué)說(shuō)認(rèn)為組織細(xì)胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，作

29、牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同，但不一定和干燥染色劑的顏色相同。,例如，品紅溶液為紅色，所染組織也為紅色，而干燥的品紅則為綠色。蘇丹類(lèi)染色劑使脂質(zhì)著色，是一種溶解現(xiàn)象。因?yàn)樘K丹類(lèi)染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度。當(dāng)蘇丹類(lèi)的酒精溶液與組織細(xì)胞中的脂質(zhì)接觸時(shí)染色劑就從酒精中溶解到脂質(zhì)中，從而使其著色。 (3)吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周?chē)芤?染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自

30、身的特性。細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對(duì)某種染色劑有吸附作用,而對(duì)別種染色劑無(wú)吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。,2.8.2.2染色的化學(xué)作用 化學(xué)作用的主要理論根據(jù) 是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動(dòng)、植物的細(xì)胞內(nèi)—般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽(yáng)離子)部分。當(dāng)堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽(yáng)離子時(shí)，就能與細(xì)胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當(dāng)酸性染

31、色劑溶液中的有色部分成為陰離子時(shí)，就能與細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合。 例如，細(xì)胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分．故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強(qiáng)，易于著色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(曙紅)的親和力很大，易于著色。,所以，在蘇木精—曙紅(H．E．)染色中，細(xì)胞核被堿性染色劑蘇木精所染，細(xì)胞質(zhì)被酸性染色劑曙紅所染。這也就是細(xì)胞核是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)是嗜酸性的。除染色質(zhì)外，粘液和軟骨的基

32、質(zhì)等都是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含的某些顆粒也為嗜酸性。須注意的是嗜堿性和嗜酸性是相對(duì)而不是絕對(duì)的，若細(xì)胞在堿性染色劑溶液中停留過(guò)久，則細(xì)胞質(zhì)也可染上堿性染色劑的顏色。某些細(xì)胞(如血細(xì)胞）具有特殊性質(zhì)，能和中性染色劑發(fā)生親和力而結(jié)合。 由此可見(jiàn)，細(xì)胞各成分的染色強(qiáng)弱是與細(xì)胞成分及染色劑的性質(zhì)有密切關(guān)系：兩者之間的親和力強(qiáng)，染色就深；親和力弱或無(wú)，染色也就淺或無(wú)。 但是，染色的實(shí)際情況是極為復(fù)雜的，組織細(xì)胞的染色作用，還隨所用溶

33、液的pH值而變動(dòng)。,2.8.3染色劑和染色液的配制 Deiafield氏蘇木精 Deiafield氏蘇木精配方 蘇木精 4g 無(wú)水酒精 25m l 10％銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液 400m1 配制時(shí)先將蘇木精溶于無(wú)水酒精，待先全溶解后加入10％銨明礬水溶液，充分?jǐn)噭?dòng)混合后

34、，注入細(xì)口瓶?jī)?nèi)，瓶口用紗布封住。然后將瓶置于溫暖有光處3—4天后過(guò)濾，濾后再加入100 m1甘油和100ml甲醇，混合均勻后，瓶口仍用紗布封口，再置于光線充足處1—2月使之成熟。待顏色變成紫褐色時(shí)即為成熟。成熟后過(guò)濾，塞緊瓶口置于陰涼處貯存， 可長(zhǎng)期保存，多年不壞。此液著色力較強(qiáng)，染數(shù)分鐘即可。也可用染液l份加蒸餾水3—5份稀釋后使用，染色時(shí)間需延長(zhǎng)一至數(shù)小時(shí)。此液染細(xì)胞核及嗜堿顆粒效果良好。染植物細(xì)胞的纖維壁比用其它任何染液著色更好

35、。,2.8.4 染色 切片可用不同方法，使其干燥，然后進(jìn)行染色。因?yàn)槊恳粡堓d片上粘貼的是蠟帶，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯，再進(jìn)入水中，才能染色，染色的方法很多，要根據(jù)每張標(biāo)本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精，伊紅染色（簡(jiǎn)稱 H·E 染色）。蘇木精使細(xì)胞核顯深紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)顯粉紅色，以此顯示清晰的細(xì)胞形態(tài)和核的大小，位置，染色后再根據(jù)制片的基本原理，使帶水的載片經(jīng)歷脫水→透明步驟最后

36、用樹(shù)膠封片。,,,HE染色：蘇木精（Hematoxylin）伊紅（Eosin）染色,堿性染料,將嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）染成藍(lán)色,酸性染料,將嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成紅色,,,,細(xì)胞核中的DNA、RNA細(xì)胞質(zhì)中的RNA,細(xì)胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)（線粒體、溶酶體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）,,,,其步驟如下： 二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→蘇木精染液→0.01%