海洋膠原肽對傷口愈合的研究

1、海洋膠原肽對大鼠剖宮產術后傷口愈合的影響,,提綱,一、研究背景二、研究目的三、材料和方法四、結果五、討論六、結論七、致謝,一、研究背景,1.剖宮產的現狀2.剖宮產的并發(fā)癥3.傷口愈合不良的危害4.傷口愈合的過程5.治療現狀6.膠原蛋白7.海洋膠原肽(MCP),剖宮產的現狀,剖宮產的現狀,,,剖宮產的現狀,中國 20世紀90年代初城市剖宮產率達20%左右；自90年代中期開始快速攀升，90年代末國內大城市醫(yī)院的剖

2、宮產率即已達到30%～40%；目前雖無全國統(tǒng)計數據，但大多數城市醫(yī)院報道的剖宮產率約在40%～60%，高者甚至達60%～80%以上。,剖宮產的并發(fā)癥,近期：麻醉意外、術后出血、產后感染、肺栓塞遠期：盆腔粘連、子宮內膜異位癥、影響子宮的解剖結構、對身體及各器官的影響、再孕時剖宮產切口瘢痕處妊娠、子宮破裂,傷口愈合不良的危害,若傷口愈合不良，將給產婦帶來術中術后出血、術后切口感染、切口裂開等危害，并增加慢性盆腔痛、盆腔粘連、子宮內膜異位

3、癥、剖宮產瘢痕妊娠(CSP)、繼發(fā)不育、流產的發(fā)生率。,傷口愈合過程,治療現狀,基因工程的應用生物工程材料的使用納米技術的應用中西醫(yī)結合技術的應用創(chuàng)面覆蓋物的應用營養(yǎng)輔助治療激光刺激高壓氧治療其他治療方法: 心理治療、 真空輔助創(chuàng)口愈合技術,膠原蛋白,膠原蛋白體外應用有改善表皮細胞微循環(huán)和促進皮膚組織新陳代謝的作用，從而加速組織再生與修復。膠原蛋白含有豐富的細胞代謝所需的氨基酸，可改善皮膚細胞的生存環(huán)境，促進皮膚組織的

4、新陳代謝。,海洋膠原肽(MCP),海洋膠原肽：氨基酸組成均衡、全面，有很好的溶解性、低黏度、高濃度、水溶性、熱穩(wěn)定性，在體內吸收快、利用率高。國內外已有部分研究論證了海洋生物活性肽對實驗動物具有抗損傷和抗氧化等功效。我們課題組以往的研究表明：海洋低聚肽具有延緩皮膚衰老、保護腎功能、調節(jié)血糖、改善老年記憶、調節(jié)免疫、防輻射及預防骨質疏松的活性；海洋膠原肽具有較強的抗氧化活性，可以清除體內的自由基，減少炎癥反應，增強小鼠免疫功能，進而增

5、強抗感染能力。,二、研究目的,觀察MCP對傷口愈合的影響 探討MCP促進愈合的作用機制,三、材料和方法,受試物：海洋膠原肽 淡黃色粉末，由北京中食海氏生物技術有限公司提供。以深海魚的魚皮為主要原料，經過清洗勻漿-復合偶聯酶解-酶失活-脫脂-多級膜分離-滲透精制-濃縮-脫色-造粒干燥等工藝制成。 根據我們課題組以往實驗及預實驗的結果，設立0.13g/kg.bw、0.38g/kg.bw、1.15g/kg.

6、bw三個MCP劑量組，對照組給予等體積溶劑灌胃。,材料,實驗動物孕16天的健康SD大鼠350~400gSPF級動物房飼養(yǎng)飼養(yǎng)環(huán)境溫度21~23℃濕度50%~60%RH,材料,主要儀器,UV7512GD型紫外可見分光光度計超速離心機XHC型漩渦混勻器電子天平光學顯微鏡－80℃低溫冰箱Pclab-UE生物醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng),主要試劑,羥脯氨酸測試盒FGF抗體TGF-β1抗體CD31兔二步法免疫組化檢測試劑盒

7、濃縮型DAB試劑盒其他試劑均為國產或進口分析純,實驗方法,動物分組及處理96只孕16天的SD大鼠，隨機分為4組，每組24只，均給予基礎飼料。經過適應性喂養(yǎng)3天后，在孕19天進行剖宮產手術，手術當天在基礎飼料的基礎上增加灌胃。低劑量MCP組，術后每天給予0.13 g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；中劑量MCP組，術后每天給予0.38g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；高劑量MCP組，術后每天給予1.15g/kg.bw劑量的海洋膠原

8、肽灌胃；空白對照組，術后每天灌胃相同體積的生理鹽水。,實驗方法,手術方案 1%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在下腹部沿腹中線切開3cm 縱切口，打開腹腔，在兩側子宮背對腸系膜側的中部各做2.0cm的縱向切口，擠出大鼠幼崽和胎盤。用5-0可吸收性外科腸線連續(xù)縫合，深腹、筋膜、腹膜用4-0絲線縫合，皮膚用4-0絲線縫合。術后涂2%碘酊，注射青霉素0.1ml，放回鼠籠里，注意保暖，術后禁食1天，正常飲水。,實驗方法,樣品的收集在術后7天、14天

9、、21天每組分別取8只大鼠，頸椎脫臼法處死動物，取傷口皮膚、子宮組織，稱重后，1/2用于測量力學指標，1/4放入液氮中迅速冷凍，-80℃冰箱中保存。剩下的1/4組織用10%中性甲醛固定后，備用。,觀察指標,一般指標：大鼠的一般情況、傷口愈合的時間、肉眼觀察情況。每周記錄大鼠體重及攝食量，每3天測量大鼠腰圍，臟器收集時觀察腹部的粘連情況，對粘連情況進行分級判斷，同時記錄子宮重量。力學指標：皮膚張力和子宮破裂壓力。羥脯氨酸含量：樣本堿水

10、解法。病理組織學檢查： HE染色、膠原染色。細胞因子的表達：免疫組織化學染色。,統(tǒng)計分析,數據以均數±標準差(?x?s)表示數據采用SPSS13.0處理計量資料采用T檢驗、單因素方差分析組間的粘連情況采用秩和檢驗檢驗水平α=0.05,四、實驗結果,1 一般指標1.1 大鼠的一般情況實驗期間各組大鼠無死亡，未出現拒食現象，動物生長及活動正常，行為、毛色、精神狀況、飲食、飲水及糞便均未見明顯異常。,1.2傷口愈合時

11、間與肉眼觀察情況,,傷口的平均愈合時間為6~7d。灌胃海洋膠原肽實驗組大鼠的傷口，比對照組大鼠傷口能提前1-2天愈合。,,肉眼觀察傷口愈合良好，未發(fā)現紅腫、積液、皮膚壞死、切口破裂等不良反應。MCP組傷口愈合后，與對照組相比，傷口表面光滑無結痂。因此認為膠原肽對傷口愈合起著顯著的愈合作用。,1.3 對大鼠體重及攝食量的影響,體重數據顯示各實驗組大鼠的體重顯現出先減少再增加的趨勢，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。,,

12、1.4 對大鼠腰圍的影響,各實驗組大鼠的腰圍均呈現出一個先下降后回升至穩(wěn)定水平的趨勢，各MCP劑量組數據與空白對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。,1.5 對大鼠腹部粘連情況的影響,對大鼠腹部的粘連情況進行分級，大鼠多為中度粘連，采用單向有序分類變量秩和檢驗，檢驗統(tǒng)計量Hc=0.359， p＞0.05，可以認為，各實驗組大鼠腹部粘連情況的差異沒有統(tǒng)計學意義。,1.6 對大鼠子宮重量的影響,2 力學指標,對數據進行單因素方差分

13、析，結果表明中劑量組在21天時皮膚張力高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；高劑量組7天和21天的皮膚張力均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。,2 力學指標,子宮壓力的數據表明，低劑量組和中劑量組的子宮壓力與空白對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。而高劑量組在在7天、21天時子宮壓力均大于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。,3 對羥脯氨酸含量的影響,4 組織病理學檢查,

14、鏡下可見較多的中性粒細胞、漿細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤，細胞間質疏松，新生的毛細血管芽和成纖維細胞增生不明顯。,鏡下可見較多的中性粒細胞、漿細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤，有新生的毛細血管芽和成纖維細胞增生。大量成纖維細胞呈梭狀，細胞質豐富，胞核較大，呈橢圓形，核仁明顯。,HE染色：術后14天,鏡下可見仍有較多炎性細胞浸潤，細長梭狀的纖維細胞排列紊亂，細胞間質水腫明顯，膠原纖維增生不明顯。,鏡下可見大量細長梭狀纖維細胞和大量束狀排列膠原

15、纖維增生。,HE染色：術后第21天,傷口表皮以增生為主，瘢痕組織較多，炎性細胞浸潤較多。,傷口表皮完整，瘢痕組織明顯少于對照組，炎性細胞明顯減少。,膠原染色,MCP組有大量膠原纖維束及波浪形的彈性纖維， MCP組膠原纖維數量明顯多于對照組，且排列整齊。,5 免疫組化檢測細胞因子的表達,5.1 傷口組織中TGF-β1的表達,,術后第14、21天的傷口組織中TGF-β1表達顯著高于對照組(p<0.05)。,5.2 傷口組織中bFGF的

16、表達,術后第7、14天高劑量組傷口組織中bFGF的表達均高于空白對照組，差異有顯著性(p<0.05)。,5.3 傷口組織中CD31的表達,CD31陽性反應出現在血管內皮細胞，用來標記微血管，7d時達到峰值，之后便呈減少趨勢，14、21d沒有發(fā)現差異性。,五、討論,1 關于動物模型和指標的選擇 動物模型：對孕鼠進行剖宮產術，建立剖宮產術動物模型，模擬了臨床剖宮產情況，形成組織形態(tài)與生物學與人剖宮產近似的傷口組織，再現了剖宮產術

17、后傷口愈合的過程。剖宮產動物模型在國內外應用較少，本實驗創(chuàng)新性的將剖宮產術大鼠模型應用于MCP對傷口愈合影響的研究，這在國內尚屬首例。 力學指標：在本研究中，我們基于剖宮產術動物模型的基礎上，由力學角度分析MCP對傷口愈合的影響，新增加了皮膚張力和子宮破裂壓力指標的測定，二者都是定量的指標，能夠更加準確的反應皮膚和子宮傷口抗拉力和伸展強度，明確判斷傷口愈合的好壞，正確的反應MCP對傷口愈合的影響，使得本實驗的結果更加科學、可信度

18、較強。,2 MCP對傷口愈合的作用,2.1 對一般情況的影響實驗期間大鼠無死亡，狀態(tài)良好，一般情況及病理均未出現明顯異常，說明MCP在本試驗劑量范圍內是安全的，對動物不產生毒副作用。各劑量組和空白對照組的體重、腰圍、攝食量、子宮重量沒有統(tǒng)計學差異，并且體重、腰圍、及子宮重量的變化均呈現出由高到低的變化趨勢，與各個時間點的生理狀況相吻合，符合孕鼠產后身體及子宮復舊的正常生理變化，說明MCP不影響孕鼠正常的身體恢復。,2 MCP對傷口

19、愈合的作用,2.2 縮短傷口愈合時間 本研究結果表明MCP組大鼠傷口愈合的時間明顯小于對照組，這說明MCP可以縮短傷口組織愈合的時間，減少產婦術后傷口治療的過程，對于減少住院時間，降低醫(yī)療費用有一定的意義。2.3 增加傷口組織的力學指標 本研究結果表明MCP能增加術后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力，這對于剖宮產婦來說極為重要。術后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力的增加，意味著產婦術后傷口愈合良好，皮膚的伸展性恢復得較好，抗拉

20、力的強度增大，可以承受住剖宮產術后再次妊娠，從而減少CSP的發(fā)生，降低剖宮產術后再次妊娠的風險。,2 MCP對傷口愈合的作用,2.4 對傷口組織形態(tài)學的影響MCP能增加早期傷口組織中新生毛細血管和成纖維細胞的生成，縮短傷口愈合過程中的炎癥反應期，促進傷口組織成纖維細胞及早形成，促進血管再生，從而改善傷口組織中微循環(huán)，增加局部供氧，促進微血管和膠原生成，加快傷口愈合。,3 MCP促進傷口愈合的機制,1 增加氨基酸原料的供給。

21、 創(chuàng)傷愈合的一個重要過程，是成纖維細胞利用氨基酸原料，合成膠原蛋白，如果氨基酸原料供給不足，必將造成愈合延遲。羥脯氨酸是構成結締組織膠原的重要成分，對膠原蛋白分子在生理溫度下形成三股螺旋的繩狀結構及其穩(wěn)定性具有重要意義，其含量多少與結締組織的抗拉力強度有很大關系。本研究中高劑量組皮膚傷口中羥脯氨酸的含量在3個時間點上均高于對照組，說明MCP能夠能夠提供充足的氨基酸原料，促進傷口中羥脯氨酸含量的增加，從而利于膠原蛋白的合成，增加膠原蛋白

22、分子的穩(wěn)定性，增強皮膚的抗拉力強度，促進傷口愈合。我們課題組以往的研究表明MCP可通過促進傷口皮膚膠原蛋白的合成，從而促進傷口愈合，結論與本研究相一致。,3 MCP促進傷口愈合的機制,2 促進傷口愈合的修復細胞的形成，特別是增加參與肉芽組織形成的成纖維細胞。 本實驗傷口7天的病理學檢查和免疫組化結果均表明成纖維細胞的數量和膠原纖維的含量明顯增加，MCP可通過增加成纖維細胞的數量和膠原纖維的含量，從而促進傷口的愈合。,3 MCP

23、促進傷口愈合的機制,3 為皮膚提供營養(yǎng)物質。 傷口愈合的過程需要以營養(yǎng)為基礎，而MCP可以增加新生血管的形成，改善血循環(huán)，增加傷口組織局部營養(yǎng)，為傷口愈合提供充足的營養(yǎng)。4 縮短愈合過程中的炎性反應期。 MCP可在早期增加傷口組織中炎性細胞的浸潤，縮短愈合過程中的炎性反應期，從而縮短愈合時間，促進傷口愈合。,3 MCP促進傷口愈合的機制,5 促進生長因子表達。 本實驗結果表明MCP可以增強TGF-β1、bFGF、

24、CD31的表達，提示在傷口的愈合過程中：（1）MCP可能通過增強TGF-β1的表達，促進產生膠原纖維和ECM，誘導肉芽組織生長和表皮形成，來促進傷口的愈合。（2）MCP可增強傷口組織中bFGF的表達，并維持在較高的水平，從而增加新生血管的形成，促進血管平滑肌細胞、內皮細胞增生，參與炎癥反應和組織修復，縮短傷口愈合時間，促進傷口的愈合。（3）MCP組微血管計數（CD31）在7d時顯著高于對照組，而且病理學觀察也發(fā)現術后7dMCP組毛

25、細血管數量最多，說明MCP能增加毛細血管的數量，為創(chuàng)面的快速愈合提供了良好的血供，從而促進傷口的愈合。,六、結 論,MCP對傷口愈合有明顯的促進作用MCP可以促進膠原蛋白的合成MCP可以提高傷口皮膚的張力 MCP能增強子宮的壓力MCP可影響傷口組織中TGF-β1、bFGF、CD31的表達，通過促進血管形成、炎癥反應發(fā)揮其促進傷口愈合的作用,,目前，剖宮產率居高不下并有逐漸升高的趨勢，傷口愈合不良，將減緩愈合過程，增加產后并發(fā)癥